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青鹏软膏作为一种经典外治藏药，是由镰形棘豆、亚大黄、铁棒锤、诃子、毛诃子、余甘子、安息香、宽筋藤及人工麝香九味药材组成的复方制剂[1]。镰型棘豆具有消炎、消肿、伤口愈合、止血和祛痒等功效，为君药；亚大黄和宽筋藤两味药特有清湿、清热、祛风等功效，共为臣药；铁棒锤、安息香、人工麝香三药配伍可增强君臣药的消炎、消肿功效，为佐药；诃子、毛河子、余甘子可调和诸药，平衡寒热，为使药[2]。诸药合用共同发挥活血化瘀、消肿止痛、抗炎抗过敏、祛风除湿、促进伤口愈合等多种功效[3]。目前临床上青鹏软膏多用于各类骨关节病及皮肤疾病的治疗，具有疗效良好、安全性高、使用方便等优点[4]。然而，当前对青鹏软膏药效物质基础研究较少，其发挥药效的化学成分尚未完全阐明，因此本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术，在正、负离子模式下对青鹏软膏中间体、青鹏软膏制剂、皮肤给药后大鼠皮肤滞留成分及入血成分进行分析，全面系统地鉴定其体内外化学成分，初步探究其药效物质基础，旨在为后续青鹏软膏的药效机制研究及质量控制研究提供参考。

1 材料

1.1 实验仪器

Triple TOF 6600TM 型飞行时间质谱联用仪，购自美国SCIEX公司；Nexera 系列超高效液相色谱仪, 购自日本SHIMADZU公司；Shim-pack GIST C18色谱柱，购自日本岛津公司；Legend Micro 17R台式离心机（离心半径：86 mm），购自美国赛默飞世尔科技公司；TARGIN VX-Ⅱ型多管涡旋振荡器，购自北京踏锦科技有限公司；KQ5200DE型数控超声波清洗器，购自昆山市超声仪器有限公司。

1.2 药物与试剂

青鹏软膏（批号：2312401）由西藏奇正藏药有限公司提供；青鹏软膏中间体由实验室自制；镰形棘豆（批号：YL-819-2411-001）、铁棒锤（批号：YL-718-2406-001）、亚大黄（批号：YL-915-2410-001）、诃子（批号：YJ-236-2404-001）、毛诃子（批号：YJ-301-2404-001）、余甘子（批号：YL-466-2409-001）、安息香（批号：YJ-501-2404-001）、宽筋藤（批号：YL-349-2409-001）均购自安徽贺林中药饮片科技有限公司；对照品香草醛（批号：C15932885）、鼠李柠檬素（批号：C16406040）、芝麻素（批号：C10331031）、大黄素（批号：C17330507）、水苏碱（批号：C17710145）、鼠李素（批号：C17628279）、补骨脂乙素（批号：C16892346）、6-姜酚（批号：C17421640）均购自上海麦克林生化科技股份有限公司；附子灵（批号：A06GB157189）、苹果酸（批号：A091B222542）、苦马豆素（批号：KB356763）、阿魏酰酪胺（批号：JS251736）、松柏醛（批号：KB366007）、对羟基苯甲醛（批号：Y02J7C15574）、原儿茶酸（批号：JB251368）、云实酸（批号：N091B231684）、丹皮酚（批号：N22HB201956）、苯甲酰乌头原碱（批号：B25071）均购自上海源叶生物科技有限公司；十五烷酸（批号：J2209259）、对羟基苯甲酸（批号：E2506179）、麝香酮（批号：F2426228）、阿魏酸（批号：E2512237）、5-羟甲基糠醛（批号：K2404307）、柯里拉京（批号：J2307052）、大黄酚（批号：H2322183）、对羟基苯乙酮（批号：D2510436）均购自上海阿拉丁试剂有限公司；2，4-二羟基二氢查耳酮（批号：WP25052005）、2，4-二羟基查耳酮（批号：WP25021103）均购自维克奇有限公司；乌头碱、次乌头碱混合对照品（批号：112029-202302）购自中国食品药品检定研究院；3-脱氧乌头碱（批号：19022-G240701）、尼奥林（批号：17161）、宋果灵（批号：18887）、3-乙酰乌头碱（批号：16982）均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司。

1.3 动物

健康雄性SD大鼠12只，200～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2021-0003，实验动物使用合格证号：110011251105018441，实验动物使用许可证号：SYXK（津）2024-0003，饲养于中国医学科学院放射医学研究所的SPF级动物房中。所有动物实验均获得中国医学科学院放射医学研究所动物伦理委员会批准（IRM/2-IACUC-2509-020）。

2 方法与结果

2.1 青鹏软膏中间体的制备

精密称取镰形棘豆粉末1 g、铁棒锤粉末0.75 g、亚大黄粉末0.5 g、诃子粉末1 g、毛诃子粉末1 g、余甘子粉末1 g、安息香粉末0.35 g、宽筋藤粉末1.5 g，混匀即得。

2.2 混合对照品溶液的制备

精密称取各个对照品，加入对应体积的甲醇，制成1 mg/ml的对照品母液，再用甲醇稀释制成5 μg/ml混合对照品溶液供进样使用。

2.3 青鹏软膏中间体供试品溶液的制备

将“2.1”项制得的7.1 g中间体，置于具塞锥形瓶中，加入95%乙醇30 ml，将样品超声处理50 min，测得样品温度升高至28 ℃左右，待其自然冷却至室温后，补足失量，以12 000 r/min转速离心5 min，离心后取上清液Ⅰ，残渣再加60%乙醇30 ml，再将样品超声处理30 min，待其自然冷却后，补足失量，随后以12 000 r/min转速离心5 min，离心后取上清液Ⅱ，将上清液Ⅰ和Ⅱ合并后氮吹，再加入5 ml甲醇溶解，过0.22 μm微孔滤膜，即得[5]。

2.4 青鹏软膏供试品溶液的制备

精密称取青鹏软膏20 g，后续超声及氮吹操作同“2.3”，再加入2 ml甲醇溶解，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.5 生物样本的采集

将大鼠随机分为空白组和给药组，每组6只。空白组和给药组均脱去背部4 cm×4 cm区域毛，随后空白组给予常规饲养不做其他任何处理，相关文献指出，乳膏外用剂量的确定应在病变面积决定用药面积的基础上，将药物浓度控制在涂抹厚度为2 mm左右为宜，青鹏软膏密度约为1 g/cm3，由此计算得出给药剂量约为0.2 g/cm2，给药组于背部脱毛区域涂抹0.2 g/cm2青鹏软膏[6-7]。临床上青鹏软膏的疗程多为14 d，故给药14 d，2次/d，于第14天给药12 h后取材[8]。将大鼠麻醉后取腹主动脉血于抗凝管中，在4 ℃条件下以3 000 r/min的转速离心10 min，分离得到的上清液即为血浆，后取大鼠背部脱毛区域皮肤，保存备用[9]。

2.6 生物样本的制备

2.6.1 血浆样品分别吸取空白组和给药组各大鼠血浆80 μl于离心管中，各组混匀后分别加入1.5 ml乙腈甲醇混合液（1∶1），混匀后静置10 min，于4 ℃下以12 000 r/min转速离心10 min，取其上清液，氮吹。再加入400 μl甲醇溶解，后超声处理10 min，于4 ℃条件下以12 000 r/min转速离心15 min，取上清液，经0.22 μm的微孔滤膜滤过，待测[9-10]。

2.6.2 皮肤样品分别称取空白组和给药组各大鼠皮肤0.1 g，各组混匀后分别加入3 ml乙腈甲醇混合液（1∶1）后剪碎，-50 ℃匀浆后涡旋2 min，超声10 min，后续离心、氮吹及复溶操作与“2.6.1”项下相同，后超声处理5 min，于4 ℃下以12 000 r/min转速离心10 min，取上清液，经0.22 μm的微孔滤膜滤过，待测。

2.7 液相条件

Shim-pack GIST C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈和0.1%甲酸水溶液（流动相A为有机相，流动相B为水相）；梯度洗脱顺序为0～20 min，80%～60%B；20～25 min，60%～30%B；25～45 min，30%～20%B；45～50 min，20%～10%B；50～52 min，0%B；52～53 min，0%B；53～54 min，0%～80%B；54～55 min，80%B；柱温设定为40 ℃；进样体积为10 μl；流速控制在0.6 ml/min。

2.8 质谱条件

离子扫描模式：电喷雾正、负离子模式；MS扫描范围设定在50～1 200，MS2扫描范围设定在30～1 000；离子源温度维持在550 ℃；离子喷雾电压设定为5 500 V/-4 500 V；离子源气体1设定为55 psi；离子源气体2设定为55 psi；气帘气压力设定为35 psi；去簇电压设定为+/-60 V；MS碰撞能设定为+/-10 eV，MS2碰撞能设定为+/-35 eV。

2.9 数据处理与分析

查阅国内外有关青鹏软膏所含九味药材化学成分的相关文献，归纳整理并建立数据库[11-18]。采用UPLC-Triple-TOF-MS/MS对青鹏软膏中间体供试品溶液、青鹏软膏供试品溶液、大鼠皮肤及血浆样品溶液进行测定，采集所有样品的二级质谱图，将采集到的各二级质谱图输入Peakview2.2软件中，筛选Mass Error ≤6 ppm的化合物，对筛选成分的保留时间和二级离子碎片等质谱信息与HR-MS/MS Spectral Library 1.1质谱数据库中的信息进行比对，结合前期文献收集到的质谱信息和对照品比对确定化合物的结构[19-20]。

2.10 青鹏软膏体内外化学成分鉴定

采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术，按“2.7”和“2.8”项下色谱、质谱条件分别对对照品混合溶液、青鹏软膏中间体供试品溶液、青鹏软膏供试品溶液、大鼠皮肤及血浆样品溶液进行数据采集分析，得到正、负离子模式下各供试品和样品的基峰色谱图，见图1～3。青鹏软膏中间体中共分离并鉴定出149个化学成分，青鹏软膏制剂中共分离并鉴定出102个化学成分，主要为黄酮类、生物碱类、有机酸类和醛类化合物；皮肤中共分离并鉴定出39种原形成分，血浆中共分离并鉴定出17种原形成分，主要为黄酮类和有机酸类化合物。本研究以五类化合物的典型化学成分为例阐述成分鉴定[21]。

2.11 黄酮类化合物的质谱裂解规律

在鉴别出的黄酮类化合物中包括芒柄花素、乔松素、柚皮素等。其中，芒柄花素是棘豆的主要成分，正离子模式下，该化合物在正离子模式下的准分子离子峰为m/z 269.080 1[M+H]+，裂解过程中得到主要的二级碎片离子有m/z 254.049 5[M+H-CH3]+、m/z 226.062 7[M+H-C2H3O]+、m/z 136.014 9[M+H-C2H3O-C6H2O]+，经与数据库比对，结合已有文献，该化合物应为芒柄花素[22]；其library数据库MS2镜像图及可能的裂解途径见图4、5。

2.12 生物碱类化合物的质谱裂解规律

在鉴别出的生物碱中，多数来源于铁棒锤，包括乌头碱、次乌头碱、宋果灵等，以乌头碱为例进行裂解规律分析，正离子模式下，该化合物准分子离子峰m/z 646.320 7 [M+H]+，碰撞裂解过程中得到的主要碎片离子峰有m/z 554.272 0[M+H-CH3OH-CH3COOH]+、 m/z 536.2620 [M+H-CH3OH-CH3COOH-H2O]+、m/z 105.033 2[M+H-C27H43NO10]+，经与标准品比对以及数据库匹配，鉴定该化合物为乌头碱[23]；其library数据库MS2镜像图及可能的裂解途径见图6、7。

2.13 有机酸类化合物的裂解规律分析

在鉴定出的有机酸类化合物中，酚酸占据多数，该类化合物在裂解过程中易丢失H2O、CO2和COOH等分子，其中阿魏酸为余甘子和毛诃子的主要成分。负离子模式下，该化合物准分子离子峰m/z 193.050 5[M-H]-，碰撞裂解得到主要的碎片离子峰m/z 178.026 7[M-H-CH3]-、m/z 165.015 4[M-H-CO]-、m/z 149.059 1[M-H-CO2]-、m/z 134.037 0[M-H-CO2-CH3]-和m/z 121.030 5[M-H-CO2-CO]-，经与数据库、对照品和文献报道对比后鉴定该化合物为阿魏酸[24]；其library数据库MS2镜像图及可能的裂解规律见图8、9。

2.14 醛类化合物的质谱裂解规律

在鉴定出的醛类化合物中，5-羟甲基糠醛是棘豆、铁棒锤、宽筋藤、余甘子、毛诃子、诃子多种药材的共有成分。正离子模式下，5-羟甲基糠醛的准分子离子峰为m/z 127.038 7[M+H]+，对其进行碰撞裂解，得到主要的碎片离子为m/z 136.061 4[M+H-C5H8O4]+和m/z 119.034 5[M+H-C5H8O4-NH3]+，经与数据库比对，结合已有文献，鉴定该化合物为5-羟甲基糠醛[25]；其library数据库MS2镜像图和可能的裂解规律见图10、11。

2.15 其他类化合物的质谱裂解规律

除以上类型化合物外，还鉴别出氨基酸类、鞣花鞣质类、蒽醌类、萜类、芳香类、木质素类苷类及大环酮类化合物，其中苯丙氨酸属于氨基酸类化合物，是余甘子和诃子共有的成分，正离子模式下，该化合物准分子离子峰m/z 166.086 3 [M+H]+，对其进行碰撞裂解，得到主要碎片离子峰有m/z 77.038 7[M+H-COOH-NH3-C2H3]+、m/z 91.054 2[M+H-COOH-CH-NH3]+、m/z 120.081 6[M+H-H2O-CO]+、m/z 120.081 6[M+H-H2O-CO-NH3]+ ，经与数据库比对，结合已有文献，鉴定该化合物为苯丙氨酸[26]；其library数据库MS2镜像图和可能的裂解规律见图12、13。

3 讨论

本研究对青鹏软膏全方中间体到复方制剂再到经皮给药后大鼠体内皮肤滞留和吸收入血这一过程中药物成分的变化情况进行了全面系统的分析鉴定，根据青鹏软膏现行标准中制备工艺，青鹏软膏中间体是由镰形棘豆、亚大黄、铁棒锤、诃子、毛诃子、余甘子、安息香、宽筋藤八味药混匀，粉碎成细末即得；青鹏软膏制剂是将上述制得的中间体加入液体石蜡、甘油及适量乳化剂和水等在80℃左右搅拌制膏，待降温至38 ℃时加入人工麝香，搅拌均匀即得。从本研究结果来看，中间体鉴定出149种成分，制剂鉴定出102种，青鹏软膏中间体与制剂的成分差异除了体现在中间体不含人工麝香这一味药中的麝香酮，还体现在制剂过程中可能因高温导致成分降解同时具有一定减毒作用，例如生物碱类从29种减少至19种，推测铁棒锤中双酯型乌头碱，如新乌头碱受热不稳定，高温下极易分解，转化为毒性更低的单酯型生物碱，这也与青鹏软膏质量控制需严格监测乌头类生物碱含量的要求一致[27]。

青鹏软膏作为一种经皮给药的外用藏药，不仅可通过作用于皮肤发挥局部的治疗效果；还可经皮吸收入血进入体循环而发挥全身的治疗效果。为明确青鹏软膏经皮给药后发挥药效的物质，本研究对其经皮给药后的大鼠皮肤滞留成分和入血成分分别进行鉴定分析。结果发现皮肤滞留成分共鉴定出39种原形成分，其中有机酸类占比最高，其次为黄酮类。没食子酸属于有机酸类，是臣药宽筋藤的主要成分，而2，4-二羟基查耳酮属于黄酮类化合物中的查耳酮类，是君药镰形棘豆的主要成分，二者均具有良好的抗炎镇痛、抗菌、抗凋亡、抗癌等多种药理作用[12,28]。皮肤滞留成分可揭示青鹏软膏局部药效的物质基础，而入血成分则可揭示其全身药效的潜在靶点，结果显示，经皮给药后在大鼠血浆中共检测到17种原形成分，其中2，4-二羟基二氢查耳酮属于黄酮类化合物中的二氢查耳酮类，是皮肤和血浆中检测到的共有成分，同样是君药镰形棘豆的主要成分，其具有良好的抗炎和镇痛活性，同时在抗菌，抗氧化剂，抗肿瘤，抗心血管疾病和止血活性方面也有很好的效果[29]。

以上各类皮肤滞留成分和入血成分的功效及药理作用与文献报道中青鹏软膏可广泛用于关节肌肉肿痛类疾病，以及皮炎、湿疹类皮肤疾病相符合，初步推测已鉴定出的39种皮肤滞留成分和17种入血成分可能是青鹏软膏的主要药效物质，但未来仍需结合这些成分开展细胞实验、动物实验等，深入探究其抗炎、抗凋亡、抗氧化等药效机制，对青鹏软膏药效物质基础进行更为全面的验证，为后续青鹏软膏的药效机制及质量控制研究提供参考。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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【作者机构】	天津中医药大学研究生院；中国医学科学院放射医学研究所
【分类号】
【基金】	西藏自治区科技计划项目（XZ202401ZY0015）。

基于UPLC-Q-TOF-MS/MS 技术的青鹏软膏体内外化学成分分析

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