DOI:10.20047/j.issn1673-7210.25080780
中图分类号:R737.33
SATB2及LDHA在子宫平滑肌瘤中的表达及相关性分析
陈曦， 李秀明
| 【作者机构】 | 苏州大学附属第一医院病理科 |
| 【分 类 号】 | R737.33 |
| 【基 金】 |
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SATB2及LDHA在子宫平滑肌瘤中的表达及相关性分析
子宫平滑肌瘤是女性常见的良性肿瘤，发病率为25%~50%，临床症状多为子宫出血、不良妊娠等[1]。手术是目前最有效的治疗方法，药物治疗主要用于短期治疗，目前尚无药物被证实可长期有效应用[2]。平滑肌瘤的发生机制复杂，其与代谢调控异常密切相关[3-4]。LDHA是肿瘤糖酵解代谢过程中催化丙酮酸转化为乳酸的关键酶，在肿瘤（如子宫平滑肌肉瘤、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜癌及乳腺癌等）中高表达，其促癌效应已得到证实[5-7]。通过药物或小分子调节LDHA可作为癌症治疗的新策略[8]。研究报道，子宫平滑肌瘤患者血清中LDHA表达升高，但LDHA在子宫平滑肌瘤组织中的表达及作用尚不明确[9]。SATB2是一种转录因子，在多种子宫肉瘤和宫颈神经内分泌癌中的表达升高，是区别子宫内膜间质结节和肉瘤的敏感标志物[10]。有研究显示，SATB2与SATB1具有高度同源性，在卵巢癌中沉默SATB1可以显著降低乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）表达水平[11]。目前，鲜见关于SATB2和LDHA在子宫平滑肌瘤中表达及作用的相关报道，本研究旨在探讨SATB2和LDHA在子宫平滑肌瘤中的表达及其相关性，以期明确其在平滑肌瘤发生、发展中的作用，为子宫平滑肌瘤的靶向药物干预提供分子标志物。
1 资料与方法
1.1 TNMplot数据库及GEO数据库
在TNMplot数据库的Gene expression comparison模块中，通过搜索关键词“uterus”，选择TNM-plot：compare Tumor and Normal，分析子宫肿瘤Gene chip based data数据中肿瘤组织（154例）及正常组织（66例）SATB2、LDHA mRNA表达。Correlation analysis法分析SATB2、LDHA mRNA表达相关性。
在GEO数据库中通过关键词“Uterine leiomyoma”筛选到2个子宫平滑肌瘤研究数据集GSE23112（5例配对的肿瘤组织及瘤旁正常组织）和GSE593（非配对的5例肿瘤组织及5例瘤旁正常组织），通过GEO2R下载相关数据，分析SATB2、LDHA mRNA表达。
1.2 临床数据
1.2.1 一般资料
收集2023年3月至12月苏州大学附属第一医院病理科100例配对子宫平滑肌瘤组织及瘤旁正常组织（取距肿瘤边缘＞2 cm处，经病理检查证实无肿瘤细胞浸润）。纳入标准：①年龄20~60岁；②符合《子宫肌瘤的诊断和治疗共识》[12]中的平滑肌瘤诊断标准。排除标准：①肿瘤组织坏死及明显细胞异型性；②患者术前经过治疗。组织样本分别置于4%甲醛溶液中固定或液氮中保存。本研究经苏州大学附属第一医院医学伦理委员会审查批准，批件号：（2025）伦审第155号。
1.2.2 主要试剂
SATB2单克隆抗体（货号：ZM-0163，克隆号：OTI5H7，北京中杉金桥生物技术有限公司）；LDHA单克隆抗体（货号：19987-1-AP，武汉三鹰生物技术有限公司）；Power SYBR Green PCR Master Mix（货号：4309155，美国ABI公司）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis试剂盒（货号：A25742，美国ABI公司）。
1.2.3 研究方法
1.2.3.1 RT-qPCR法 取组织样本约30 mg置于研磨器中充分研磨，收集研磨液于1.5 ml离心管中，加入1 ml Trizol振荡裂解2 h，依次加入氯仿、异丙醇、75%乙醇提取RNA，测量RNA浓度；使用反转录试剂盒将提取的RNA反转录成cDNA，将样品cDNA与LDHA或SATB2引物混合体系进行PCR反应，反应体系（20 μl）：SYBR Green 10 μl，模板cDNA 2 μl，正向引物0.4 μl，反向引物0.4 μl，DEPC Water 7.2 μl。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火1 min，40个循环后72 ℃延伸30 s，采用2-ΔΔCt计算相对表达量。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列及长度见表1。
表1 引物序列
引物长度SATB2正向引物：CTTTGCAAGAGTGGCATTCA 20反向引物：GTTGTCGGTGTCGAGGTTTT 20基因名称引物序列（5’→3’）（bp）LDHA正向引物：ATGGCAACTCTAAAGGATCAGC 22反向引物：CCAACCCCAACAACTGTAATCT 22β-actin正向引物：TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC 25反向引物：TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG 25
1.2.3.2 HE染色 二甲苯对组织切片进行脱蜡，梯度乙醇（100%→80%）进行复水处理。切片浸入苏木精中2 min，流水冲去浮色，再分化之后放置于流水下10~15 min，显微镜观察至细胞核变成蓝色为止；切片浸入伊红中1 min，流水冲去浮色，经过80%、95%、100%的酒精脱色，浸入二甲苯2次各5 min，用中性树胶封片，待树脂晾干后可长期保存，400倍显微镜下摄取图片。
1.2.3.3 免疫组织化学染色法 石蜡切片放置在60 ℃恒温箱中烘烤120 min。脱蜡和水化：二甲苯（20 min）→二甲苯（20 min）→无水乙醇（5 min×2次）→95%乙醇（5 min×2）→90%乙醇（5 min）→80%乙醇（5 min）；30%过氧化氢+蒸馏水混合，室温5~10 min以灭活内源性酶。微波抗原修复：将切片浸入0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH=6.0）中，循环2~3次。滴加0.02 mol/L PBS稀释的正常山羊血清封闭液（1∶10），室温20 min。滴加适当稀释的一抗（1∶1 000），4 ℃过夜。加入生物素化山羊抗小鼠IgG（1∶10 000）或者与一抗对应的二抗，20~37 ℃孵育20 min。DAB显色，蒸馏水洗涤。苏木精轻度复染，脱水，透明，封片，观察，400倍显微镜下摄取图片。蛋白表达量的统计方法：通过Image J软件测量每张切片中SATB2和LDHA蛋白表达的累积光密度值及区域面积值，计算平均光密度值。平均光密度值=累积光密度值/区域面积，反映目标蛋白单位面积的浓度[13]。实验独立重复3次。
1.3 统计学方法
采用GraphPad Prism 9.0统计学软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（
）表示，比较采用t检验；相关性采用简单线性回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 TNMplot数据库中子宫肿瘤SATB2、LDHA mRNA表 达及相关性
肿瘤组织SATB2、LDHA mRNA表达高于正常组织（P＜0.05）；SATB2 mRNA与LDHA mRNA表达呈正相关（r=0.242，P=0.012）。见图1。
图1 子宫肿瘤SATB2、LDHA mRNA表达及相关性
2.2 GEO数据库中子宫平滑肌瘤SATB2、LDHA mRNA表 达比较
肿瘤组织SATB2、LDHA mRNA表达高于正常组织（P＜0.05）。见图2。
图2 GSE23112和GSE593数据集中SATB2和LDHA的mRNA表达分析
2.3 病理结果
HE染色结果显示，肿瘤组织由密集的梭形平滑肌细胞组成，呈编织状或束状无序排列。细胞核呈长杆状，两端钝圆且边缘清晰，密度显著增高，排列方向紊乱，核分裂象罕见。胞质丰富且嗜酸性，其间可见受压变性的薄壁血管，分布不均，间质存在不同程度的透明变性。肿瘤组织与瘤旁正常组织之间可见清晰分界。镜下瘤旁正常组织中，细胞呈分层有序的平行排列，细胞核长梭形，大小及方向相对一致，血管分布均匀。见图3。
图3 瘤旁正常组织及肿瘤组织病理（HE染色，×400）
2.4 肿瘤组织和瘤旁正常组织SATB2、LDHA蛋白表达比较
肿瘤组织中SATB2蛋白表达呈细胞核弥漫强阳性或部分细胞散在中等强度阳性，瘤旁正常组织中SATB2蛋白表达呈阴性或少量细胞弱阳性；肿瘤组织中LDHA蛋白表达呈细胞质弥漫强阳性或散在阳性，瘤旁正常组织中LDHA蛋白表达呈阴性或弱阳性。肿瘤组织SATB2、LDHA蛋白表达高于瘤旁正常组织（P＜0.05）。见图4。
图4 免疫组织化学染色法检测子宫平滑肌瘤组织中SATB2、LDHA蛋白表达（×400）
2.5 肿瘤组织和瘤旁正常组织SATB2、LDHA mRNA表 达比较
肿瘤组织SATB2、LDHA mRNA表达高于瘤旁正常组织（P＜0.05）。见图5。
图5 RT-qPCR法检测子宫平滑肌瘤组织中SATB2、LDHA mRNA表达
2.6 子宫平滑肌瘤组织中SATB2与LDHA mRNA相关性
SATB2 mRNA与LDHA mRNA表达呈正相关性（r=0.313，P=0.002）。见图6。
图6 子宫平滑肌瘤中SATB2 mRNA与LDHA mRNA表达相关性
3 讨论
平滑肌瘤是子宫最常见的良性肿瘤，分子生物学研究显示，平滑肌瘤由单克隆平滑肌细胞增殖形成，多发性平滑肌瘤可能有共同的克隆起源；这一发现提示多发性平滑肌瘤的异质性较小，可能对药物靶向治疗有更好的反应[14]。平滑肌瘤临床药物治疗的目标主要是缓解患者症状和控制肌瘤的生长，目前尚无药物能够长期安全有效地用于子宫平滑肌瘤的治疗。因此，寻找可长期且有效的潜在靶向标志物对子宫平滑肌瘤的治疗和预后评估具有重要意义。研究显示，子宫平滑肌瘤的发生与代谢调控紊乱密切相关，脂肪细胞通过上调相关因子如白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、单核细胞趋化因子-1、粒细胞巨噬细胞刺激因子、转化生长因子β、胎盘生长因子、血管内皮生长因子、肝素结合表皮生长因子、粒细胞集落刺激因子及成纤维细胞生长因子2表达，促进子宫平滑肌瘤的细胞炎症、纤维化及血管新生[3]；在子宫肌瘤患者中，炎症反应与脂质代谢水平之间存在显著相关性[4]。
糖酵解是肿瘤细胞发生、发展的关键步骤之一，其代谢终产物——乳酸能够促进肿瘤细胞的存活、转移、侵袭、免疫逃逸及血管生成等行为[15]。研究显示，延胡索酸水合酶（fumarate hydratase，FH）基因突变导致FH活性完全丧失或降低，造成细胞内延胡索酸积累，糖酵解加强，引起不依赖低氧环境的低氧诱导因子-1α稳定表达，导致平滑肌瘤的发生[16]。与FH类似，LDHA也是糖酵解过程中丙酮酸转化为乳酸所必需的关键酶，在多种恶性肿瘤中高表达，且LDHA高表达与肿瘤患者的不良预后及转移密切相关，LDHA常作为肿瘤诊断及特征的生物学指标[17]。研究显示，血清LDHA可用于术前子宫平滑肌瘤和子宫平滑肌肉瘤的鉴别诊断，而LDHA在子宫平滑肌瘤中的表达及功能鲜见相关报道[18]。本研究首先通过TNMplot及GEO数据库分析LDHA表达，随后通过RT-qPCR及免疫组织化学染色法检测子宫平滑肌瘤中LDHA mRNA和蛋白表达，结果显示，肿瘤组织LDHA mRNA和蛋白表达高于瘤旁正常组织，提示LDHA可能在子宫平滑肌瘤中发挥促肿瘤发生的作用，同时也提示LDHA与肌瘤的代谢特征密切相关。
有研究显示，通过在子宫平滑肌细胞中过表达或抑制SATB2，显著影响细胞生长，提示SATB2可能参与平滑肌瘤的发生[19]。此外，SATB2通过调控β-catenin/TCF-LEF信号通路参与结直肠癌细胞的恶性转化、进展和转移[20]。SATB2在乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌及肺癌中均高表达，充当肿瘤促进因子。miRNA可通过调节SATB2的表达调控癌细胞的增殖、迁移、侵袭和转移[21]。虽然，目前缺少SATB2的药理学抑制剂，但相关遗传学研究显示，SATB2可能是癌症治疗和预防的潜在靶点。这些研究也提示SATB2可能通过β- catenin/TCF-LEF信号通路参与子宫平滑肌瘤的发生。本研究通过TNMplot及GEO数据库分析发现，SATB2在子宫肿瘤及子宫平滑肌瘤中均高表达，通过RT-qPCR及免疫组织化学染色法检测子宫平滑肌瘤中SATB2 mRNA和蛋白表达，结果显示，肿瘤组织SATB2 mRNA和蛋白表达高于瘤旁正常组织，提示SATB2的表达升高可能是导致子宫平滑肌瘤发生的病因之一，具体的分子机制有待后续实验进行进一步的验证。
有研究显示，在卵巢癌中敲低SATB1可以显著降低LDH表达水平[11]。鉴于SATB1调控LDH表达的作用，推测SATB2可能也参与调控LDHA表达，因此，本研究进一步分析平滑肌瘤中SATB2与LDHA mRNA表达的相关性，结果显示，SATB2 mRNA表达与LDHA mRNA表达呈正相关，提示SATB2可能通过调控LDHA影响子宫平滑肌瘤的发生。
4 小结
本研究结果显示，子宫平滑肌瘤中SATB2和LDHA mRNA和蛋白均高表达，且SATB2 mRNA表达与LDHA mRNA表达呈正相关。同时，SATB2可能通过调控LDHA参与糖酵解，从而影响子宫平滑肌瘤的发生、发展，其潜在分子机制有待进一步研究。
利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。
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Expression and correlation analysis of SATB2 and LDHA in uterine leiomyoma
陈曦（1990.9-），女，硕士；研究方向：消化系统肿瘤病理。
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