原发性肝癌恶性程度高、预后差，是中国常见的恶性肿瘤之一，其5年生存率低，严重威胁人类健康[1]。多数患者确诊时已进展至晚期，治疗难度大，且存在复发和转移风险，因此亟须探索新的有效疗法[2]。

光热治疗（photothermal therapy，PTT）利用近红外光敏剂将光能转化为热能杀伤肿瘤细胞，具有无创、可控等优点[3-6]。但激光穿透深度有限，单一PTT效果常不理想[7]。PTT与化疗等其他疗法联用，有望实现协同增效[8]。脂质体作为新型药物载体，具有良好的生物相容性和可降解性，能同时包载亲水性与疏水性药物，并能提高药物有效性、降低毒性、增强稳定性，为多模式协同治疗提供理想平台[9-10]。

乌索酸（ursolic acid，UA）具有抗炎、抗肿瘤、肝脏抗纤维化等多重药理活性。但其水溶性差、生物利用度低限制了其应用[11-14]。

基于此，本研究旨在构建共载UA与IR780的纳米脂质体，将UA的化疗效应与IR780的光热效应相结合，利用脂质体实现药物的协同递送，并评估其对肝癌HepG2细胞的协同治疗效果。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1药品与试剂 UA（纯度：98.05%，货号：A11796，南京百鑫德诺生物科技有限公司）；IR780[纯度 ≥95.0%，货号：425311，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司）]；胆固醇[货号：SLCP3471，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司）]；大豆卵磷脂（货号：L8050，北京索莱宝科技有限公司）；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（货号：R2A0230324，西安瑞禧生物科技有限公司）；无水乙醇[货号：20231213，赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；DMEM培养基（货号：WHB824E271，美国Gibco公司）；4%多聚甲醛（货号：BL539A，江苏Biosharp生物有限公司）；DAPI溶液（货号：C0065，北京索莱宝科技有限公司）；PBS（无菌）（货号：B009，北京中生奥邦生物科技有限公司）；CCK8试剂盒（货号：K101847133EFSE，美国Invigentech公司）。

1.1.2 细胞 HepG2细胞，培养条件：置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

1.1.3 仪器 电子天平（型号：PX224ZH，精度：0.1 mg，美国OHAUS公司）；旋转蒸发仪（型号：R-300，瑞士BUCHI公司）；激光粒度仪（型号：Nano-ZS90，美国MALVERN公司）；低电压透射电镜（型号：Tecnai12，美国FEI公司）；激光共聚焦显微镜（型号：LSM800，德国Zessi公司）；多功能酶标仪（型号：Enspire，美国PerkinElmer公司）；CO2恒温培养箱（型号：MCO-18AIC，日本SANYO公司）；高低速冷冻离心机（型号：TGD-22MC，长沙湘锐离心机有限公司）；近红外热成像仪（型号：TiS20+，美国FLUKE公司）；808 nm激光器（型号：LWIRPD-808-8F，北京镭志威光电技术有限公司）；多功能酶标仪（型号：Enspire，美国PerkinElmer公司）；激光共聚焦显微镜（德国Zessi公司，型号：LSM800）。

1.2 脂质体的制备

将DSPE-PEG2000、胆固醇及大豆卵磷脂按照4∶10∶86的摩尔比例混合，构成脂质体膜材料。UA与IR780按等质量比（1∶1）共同溶解于无水乙醇，定容至10 ml。随后通过旋转蒸发逐步除去有机相，待烧瓶内壁形成一层均匀的脂质干膜后，加入10 ml超纯水进行水化处理。在超声条件下破碎15 min，过0.45 μm微孔滤膜，即得Lip（UA/IR780）。采用相同方法，分别单独负载UA或IR780，可制得Lip（UA）和Lip（IR780）。不加入负载成分，制得空白脂质体。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 脂质体粒径、电位、电镜及光学特性 采用激光粒度仪测定各样品的平均粒径、多分散指数及表面Zeta电位，每个样品重复测定3次。分别取Lip（IR780）、Lip（UA）及Lip（UA/IR780）溶液各1.5 ml，使用紫外分光光度计进行全波长扫描，记录其吸收光谱。

1.3.2 包封率检测 分别配制不同浓度的UA及IR780溶液，测定其吸光度，绘制浓度-吸光度标准曲线。取新制备的脂质体混悬液10 ml，以9 000 r/min的转速离心30 min（离心半径10 cm），收集上清液待测。同时另取等体积未离心的脂质体混悬液，用于测定体系中药物总含量。包封率按以下公式计算，其中，W总为药物总投药量，W游离为上清液中游离药物的质量。

1.3.3 激光诱导体外升温 将808 nm激光发射器的光斑半径调节为5 mm（对应光斑面积约为0.785 cm2），并设置不同激光输出功率以获得对应的激光功率密度（0.1、0.6、1.1、1.7 W/cm2）。分别取2 ml不同质量浓度（10、25、50、100 μg/ml）的Lip（UA/IR780）溶液或PBS，置于2 ml透明玻璃比色皿中（光程1 cm）。使用激光垂直照射溶液中心区域，照射期间使用红外热成像仪，每隔30 s记录溶液中心区域的温度，总计5 min。

1.3.4 Lip（UA/IR780）的光热稳定性 取1.5 ml Lip（UA/IR780）样品置于光路中，以功率密度1.1 W/cm2的808 nm近红外激光持续辐照，待温度读数达到平台期后切断光源，使体系自发降温恢复至起始温度。全程采用红外热像仪连续采集样品中心区域的温度变化数据，据此绘制升温-降温曲线。

1.3.5 Lip（UA/IR780）的光热转换效率 设置808 nm激光器的输出参数：光斑半径5 mm（对应辐照面积0.785 cm2），功率密度1.1 W/cm2，光束垂直对准比色皿中的样品中心区域进行连续辐照，直至温度读数进入平台期。随即关闭激光源，使样品在无外界干扰条件下自发降温回到室温。整个升温与降温阶段，由红外热像仪实时记录样品中心点的温度变化，据此构建温度随时间演变的完整曲线。

光热转化效率（η）根据以下方程式计算[15]：

相关参数定义如下：h为热传导系数，S为样品容器的有效散热面积，m为被测样品质量；τs为体系的热弛豫时间，τwater为纯水的热弛豫时间，Cwater/CH2O为水的比热容。激光辐照功率密度I固定为1.1 W/cm2，A代表探针分子在808 nm波长处的吸光度值。Tsurr为环境温度，Tmax及Tmax（water）分别对应Lip（UA/IR780）溶液与纯水在辐照结束时的最高温度。t为冷却阶段的时间变量，θ为标准化温差。此外，Qdis表示单位时间内纯水在激光照射下吸收并转换成的背景热功率。

1.3.6 体外细胞摄取 用共聚焦显微镜检测HepG2对Lip（UA）、Lip（IR780）和Lip（UA/IR780）的摄取。

将HepG2细胞以每孔2×105个的密度接种至6孔板，在培养箱中生长24 h。随后移除原有培养基，更换为含有不同脂质体制剂的新鲜培养基：Lip（UA）组中UA的最终浓度为20 μg/ml（其中UA经罗丹明123染色标记）；Lip（IR780）组中IR780的最终浓度为20 μg/ml；Lip（UA/IR780）组中两种药物的终浓度均为20 μg/ml（其中UA经罗丹明123染色标记）。继续培养3 h后，用PBS漂洗细胞两次，以4%多聚甲醛室温固定20 min，再以DAPI染细胞核。最终通过共聚焦激光扫描显微镜获取各组的荧光图像。

1.3.7 体外抗肿瘤-光热实验与协同效应分析 采用CCK8实验评价脂质体的细胞毒性，并基于Chou-Talalay联合指数（combination index，CI）法对UA与IR780的协同作用进行定量评估。

设置以下分组：PBS组、空白脂质体组（Lip）、Lip（UA）组（UA：100 μg/ml）、Lip（IR780）组（IR780：100 μg/ml）、Lip（UA/IR780）组（UA：100 μg/ml；IR780：100 μg/ml）、游离UA与IR780物理混合物组（UA：100 μg/ml；IR780：100 μg/ml），将相同质量浓度的游离UA与游离IR780直接溶于培养基，超声混匀后使用。

HepG2细胞贴壁培养24 h后，吸去上清，分别加入含不同药物制剂的培养液。于37 ℃条件下继续培养3 h，随后用PBS缓冲液漂洗细胞两遍，换用不含药物的新鲜培养基。对于需要接受光热处理的组别，采用功率密度为1.1 W/cm2的808 nm激光辐照5 min；对照组则不进行辐照处理。放入培养箱继续孵育24 h后，加入CCK8溶液孵育1 h，用酶标仪测量吸光度值，计算细胞存活率。根据各单药及联合用药组的剂量-效应曲线，采用CompuSyn软件计算CI值。CI值＜1表示协同作用，CI值=1表示相加作用，CI值＞1表示拮抗作用。

1.4 统计学方法

本研究使用GraphPad Prism 8、Image J 64、ZEN 3.1及Excel软件对实验数据进行处理。所有计量资料采用均值±标准差（）表示，组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脂质体的表征

2.1.1 粒径/电位 表1显示3种脂质体[Lip（IR780）、Lip（UA）、Lip（UA/IR780）]的平均粒径、多分散指数和Zeta电位的测量结果。经测定，Lip（UA/IR780）的平均粒径为（142.300±0.910）nm。Lip（UA/IR780）的多分散指数为（0.144±0.028），电位为（-39.70±6.11）mV。见表1，图1、2。

图1 Lip（UA/IR780）粒径分布

图2 Lip（UA/IR780）Zeta电位分布

表1 不同脂质体的粒径、多分散指数及Zeta电位（，n=3）

脂质体粒径（nm）多分散指数Zeta电位（mV）Lip（IR780）140.100±0.9390.251±0.031-38.50±5.24 Lip（UA）137.500±0.9050.238±0.041-39.40±6.91 Lip（UA/IR780）142.300±0.9100.144±0.028-39.70±6.11

2.1.2 Lip（UA/IR780）的外观/电镜形态 根据前文所述脂质体的方法合成一定浓度的Lip（UA/IR780）溶液呈绿色，见图3；Lip（UA/IR780）电镜呈规则球状、大小均一，形态良好，见图4、5。

图3 Lip（UA/IR780）水溶液（绿色）外观

图4 Lip（UA/IR780）的透射电镜

图5 Lip（UA/IR780）的透射电镜

2.1.3 紫外吸收光谱 紫外吸收光谱显示，Lip（IR780）具有在805 nm处的强吸收峰，Lip（UA）峰值在203 nm处；如预期，Lip（UA/IR780）的吸收曲线有两个明显的表现，其中一个峰值位于805nm处，为IR780的特性吸收；另一个峰值在203nm处，属于UA的吸收（图6）。Lip（UA/IR780）在近红外光谱中具有如此强的吸收能力，提示其PTT的潜力。

图6 Lip（IR780）、Lip（UA）和Lip（UA/IR780）的紫外-可见-近红外吸收光谱

2.1.4 Lip（UA/IR780）包封率 UA吸光度-浓度标准曲线为Y=0.001 8+0.004X，R2=0.995 64，UA的包封率为89.35%；IR780吸光度-浓度标准曲线为Y=-0.826 8+0.411 2X，R2=0.992 68，IR780的包封率为90.39%。

2.1.5 激光诱导下Lip（UA/IR780）的体外升温 固定Lip（UA/IR780）浓度为100 μg/ml，改变激光功率密度分别为0.1、0.6、1.1、1.7 W/cm2，连续照射5 min后，测得样品所能达到的峰值温度依次为22.0、40.7、56.0、60.9 ℃（图7）。

图7 不同激光功率照射下，Lip（UA/IR780）溶液（100 μg/ml）的温度-时间变化曲线

808 nm激光辐照5 min后，不同浓度的Lip（UA/IR780）溶液有不同程度的升温幅度（图8）。在100 μg/ml的高浓度条件下，体系温度可升至55.9 ℃，净增温42.1 ℃；随着浓度递减至50、25、10 μg/ml，对应的最高温度分别为53.0、47.9、42.4 ℃，相应温差依次为39.2、34.1、28.6 ℃。上述数据提示，即便在较低浓度（10 μg/ml）下，该脂质体仍可产生近30 ℃的温度升高，显示出优异的光热升温性能。

图8 不同浓度Lip（UA/IR780）溶液及PBS对照在808 nm激光（1.1 W/cm2）照射下的温度-时间变化曲线

2.1.6 Lip（UA/IR780）的光热稳定性 连续5个“加热-冷却”循环过程中，Lip（UA/IR780）的升温曲线几乎完全重合，未出现明显衰减，提示其具备良好的光热循环稳定性（图9）。

图9 Lip（UA/IR780）溶液在5次激光开关（1.1 W/cm2）循环下的温度-时间变化曲线

2.1.7 光热转换效率计算 经808 nm激光辐照后，Lip（UA/IR780）溶液的光热转换效率测定值为40.85%，提示该脂质体具有较高的光热转化能力。

2.2 细胞实验

2.2.1 细胞摄取实验 图10显示HepG2细胞对UA/IR780的摄取情况，当HepG2细胞在Lip（UA）溶液中培养3 h后，细胞内出现明显的绿色荧光，提示Lip（UA）分散于HepG2细胞质中，结合DAPI染色后的合并图可以看出，细胞核周围也含有Lip（UA）脂质体。提示Lip（UA）可以被HepG2细胞摄取，这为载药纳米粒的细胞摄取提供了实验依据。

图10 共聚焦显微镜观察HepG2细胞对不同脂质体的摄取情况

当HepG2细胞在Lip（IR780）溶液中培养3 h后，HepG2细胞质出现红色荧光，提示Lip（IR780）被HepG2细胞摄入，IR780已被释放到细胞质中。

当HepG2细胞在Lip（UA/IR780）溶液中培养3 h后，HepG2细胞质出现绿色及红色荧光，提示Lip（UA/IR780）成功进入HepG2细胞内部，且两种药物均已从脂质体中释放并分布于细胞质中。

2.2.2 体外抗肿瘤-光热实验 CCK8实验检测结果显示：激光辐照对PBS组、空白脂质体组、Lip（UA）组细胞存活率无影响（P＞0.05）；与无激光辐照比较，有激光辐照Lip（IR780）组、Lip（UA/IR780）组、游离UA与IR780物理混合物组细胞存活率均降低（P＜0.05）。有激光辐照下，空白脂质体组与PBS组细胞存活率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；Lip（UA）组、Lip（IR780）组、Lip（UA/IR780）组细胞存活率低于空白脂质体组，Lip（UA/IR780）组细胞存活率低于Lip（UA）组、Lip（IR780）组和游离UA与IR780物理混合物组（P＜0.05）。提示Lip（UA/IR780）在细胞水平上具有显著的抗肿瘤-光热治疗协同作用。见图11。

图11 细胞存活率

在激光照射条件下，计算得到Lip（UA/IR780）在抑制HepG2细胞增殖的效应水平（如IC50）处的CI值为0.42（CI值＜1），提示UA与IR780在该体系中具有明显的协同抗肿瘤作用。见图12。

图12 Lip（UA/IR780）组细胞毒性及协同效应分析

3 讨论

研究证明，广泛存在于自然界多种植物中的UA具备多种生物活性，能通过诱导肿瘤细胞凋亡来抑制增殖，从而表现出抗癌活性[16]。UA可以抑制HepG2细胞生长，诱导HepG2中的促凋亡信号[17]。IR780，一种亲脂性阳离子染料，易于控制、能更好的穿透组织[18]。IR780因其优异的近红外区域吸收和光热转换能力而被广泛研究，并且IR780在癌症成像和光热、光动力治疗中有巨大的应用前景[19]。

相较于紫外线和可见光，近红外光具有较低的吸收系数和深穿透能力，带来的损伤轻微[20]。PTT中最常用的近红外激光器为808 nm和980 nm[21]。然而，热的不均匀使其不足以杀死所有肿瘤细胞，导致肿瘤复发和预后差，且光敏剂在体内的寿命大多较短，容易被肝脏代谢，从体内迅速清除，在肿瘤区域的积累有限，这限制了其作为单一疗法的应用，而脂质体可以有效地增强基于PTT的协同肿瘤治疗[22-23]。因此，需要联合治疗来进一步提高治疗效果。

脂质体的特点包括靶向性、降低药物毒性、延长药物血液循环时间、提高稳定性[24-25]。因其上述特性，脂质体作为载体或进行基因修饰后应用肿瘤治疗，能够更好地抑制肿瘤生长和提高传统治疗效果[26]。

基于UA固有的抗肿瘤活性与IR780优越的光疗能力，本研究采用薄膜水化法成功地构建了二者共载的脂质体纳米递送系统[Lip（UA/IR780）]。所制备的脂质体形态规则均一，粒径与Zeta电位分布符合理想纳米药物载体标准，并表现出良好的物理稳定性。

在光热性能方面，红外热成像结果显示Lip（UA/IR780）光热升温效果较好，能实现较大幅度的升温效果，达到有效杀伤肿瘤细胞所需的温度阈值（＞50 ℃）。经5个激光开/关循环后，其升温曲线未出现明显衰减，表现出优异的光热稳定性；进一步计算得出该体系的光热转换效率高达40.85%，提示其具备高效、稳定的光热转化能力。

本研究通过构建共载UA与IR780的脂质体纳米系统，成功实现了化疗与光热治疗的联合应用。在细胞毒性实验中，Lip（UA/IR780）组在激光照射下表现出最强的细胞杀伤效果。在激光照射下，Lip（UA/IR780）组细胞存活率低于游离UA与IR780物理混合物组，提示单纯物理混合虽然具备一定的联合效应，但其效果远逊于脂质体共载体系。为进一步验证二者之间的协同效应，本研究采用Chou-Talalay CI法对UA与IR780的相互作用进行定量评估。计算结果显示，在激光照射条件下，Lip（UA/IR780）在IC50效应水平对应的CI值为0.42（＜1），从定量层面证实了UA与IR780在该体系中具有显著的协同作用。这种协同效应可能源于UA诱导的细胞凋亡与IR780介导的光热损伤在细胞内的互相增强，以及脂质体载体对药物的共递送与可控释放。本研究结果不仅从细胞存活率层面，更通过定量药理学方法，为UA与IR780的协同抗肿瘤机制提供了有力证据。

综上所述，Lip（UA/IR780）作为一种集成化学治疗与光热治疗功能的共递送纳米平台，在肝癌治疗中展现出良好的应用前景与临床转化潜力。

然而，当前研究仍存在一定的不足，缺乏体内实验验证、长期毒性未评估等，可以构建裸鼠皮下肝癌模型，通过体内抗肿瘤实验（如小鼠HepG2移植瘤模型）以验证脂质体的靶向性和疗效；通过溶血实验或巨噬细胞摄取实验评估脂质体的血液相容性。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Experimental study on the antitumor-photothermal therapy of a novel coloaded ursolic acid-IR780 nanoliposome on HepG2 cells

LI Pei1 ZHAO Qianru1 XIANG Xinghua2 LIU Shuqi1 WEI Chaohua1 CHEN Qingshan2 ZHU Chaogeng2

1.The First Clinical College of Traditional Chinese Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Hunan Province,Changsha 410000, China; 2.Department of Hepatobiliary, Pancreatic, and Hernia Surgery, the First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Hunan Province, Changsha 410000, China

[Abstract] Objective To prepare a novel nanoliposome co-loading ursolic acid (UA) and IR780 dye, and to evaluate its antitumor-photothermal therapeutic effect on HepG2 cells. Methods Liposome Lip (UA/IR780) was prepared using the thin-film hydration method, and its particle size, Zeta potential, encapsulation efficiency, photothermal conversion capability, and photothermal stability were analyzed. At the cellular level, the uptake behavior of Lip (UA/IR780) by HepG2 cells was observed by laser scanning confocal microscopy. The antitumorphotothermal therapeutic effect was evaluated through cytotoxicity assay. Results Lip (UA/IR780) showed an average particle size of (142.30±0.91) nm with uniform distribution and good stability, and a Zeta potential of (-39.70±6.11) mV. The encapsulation efficiencies of UA and IR780 were 89.35% and 90.39%, respectively. Under 808 nm near-infrared laser irradiation, Lip (UA/IR780) exhibited excellent photothermal heating performance with a photothermal conversion efficiency of 40.85%. Cellular experiments demonstrated that Lip (UA/IR780) could be effectively internalized by HepG2 cells and exerted a significant antitumor-photothermal therapeutic inhibitory effect.Conclusion The novel co-loaded liposome Lip (UA/IR780) is successfully constructed, which shows significant antitumor-photothermal therapeutic inhibition on HepG2 cells, providing a new strategy for tumor therapy with potential application value.

[Key words] Antitumor-photothermal therapy; Combination therapy; Liposomes; IR780; Ursolic acid; HepG2 cells

[中图分类号] R183.6

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）05（b）-0021-07

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25111122

[基金项目] 湖南省自然科学基金面上基金项目（2023JJ30479）；湖南省卫生健康委员会科研计划课题（C202304019331）；湖南省长沙市杰出创新青年培养计划项目（kq2306029）。

[作者简介]

李佩（1999.9-），女，湖南中医药大学第一中医临床学院2023级中西医结合专业在读硕士研究生；研究方向：肝胆胰系统疾病。

[通讯作者] 陈青山（1989.11-），男，博士；研究方向：纳米中药在肝胆胰疾病中的应用。朱朝庚（1971.2-），男，博士，主任医师，硕士生导师；研究方向：肝胆胰疾病的基础及临床研究。

（收稿日期：2025-11-13）

（修回日期：2026-01-16）