根据病理分型，肺癌主要分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中起源于肺泡上皮细胞或支气管黏膜上皮细胞的非小细胞肺癌约占全部肺癌的85%[1]。据报道，20%~40%的初诊非小细胞肺癌患者存在脑组织、骨骼等远端转移，约90%的致死患者可归因于癌细胞迁移侵袭[2]。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是源自上皮细胞的恶性肿瘤发生迁移、侵袭的初始过程，有研究报道通过抑制EMT能够有效抑制非小细胞肺癌迁移和侵袭[3]。灯盏花素（breviscapine，Bre）又名灯盏细辛、灯盏乙素，是中药灯盏花富含的一种黄酮类化合物，具有较广泛的抗肿瘤活性，对胃癌、结肠癌细胞迁移、侵袭具有抑制作用[4-5]。前期研究证实Bre能够抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖并改善其化疗敏感性[6]。

Wnt/β-catenin信号通路广泛参与细胞增殖、分化、EMT、迁移、侵袭及组织再生等生理和病理过程，具有高度保守性和严格调控性[7]。临床研究发现，非小细胞肺癌组织中Wnt/β-catenin信号通路异常活化，与患者不良预后相关[8]。细胞学研究发现，通过下调Wnt/β-catenin信号通路可抑制非小细胞肺癌A549、H1299细胞迁移、侵袭和EMT[9]。Bre对Wnt/β-catenin信号通路具有抑制作用，提示Bre可能通过Wnt/β-catenin信号通路对非小细胞肺癌起到治疗作用[10]。基于此，本研究将探讨Bre对A549细胞迁移、侵袭和EMT的影响，并基于Wnt/β-catenin信号通路探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞

A549细胞购于中国科学院细胞库（目录号：SCSP-503）。

1.2 试剂与仪器

Bre（纯度 ≥95%）、Wnt/β-catenin信号通路激动剂SKL2001、含青霉素链霉素双抗的RPMI 1640培养基、0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液（货号：B-50046、T99850、R20162、R20107，上海源叶生物科技公司）；CCK-8细胞增殖检测试剂盒、结晶紫染色液、总RNA提取试剂盒、RT-qPCR试剂盒、BCA蛋白定量检测试剂盒、增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂盒（货号：G4103、G1014、G3689、G3345、G2026、G2020，武汉赛维尔生物科技公司）；Matrigel基质胶、高效RIPA裂解液、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（货号：354234、R0010、P1200，北京索莱宝生物科技公司）；基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2、MMP-9、GAPDH抗体（货号：10373-AP、10375-AP、10494-1-AP，武汉三鹰生物技术公司）；N-cadherin、E-cadherin、Vimentin、Wnt3a、β-catenin、糖原合成激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）、Snail抗体和IgG二抗（货号：AF5239、AF0131、AF7013、DF6113、AF6266、AF5016、AF6032、S0001，美国Affinity公司）。CO2细胞培养箱（型号：BPN-80CW，上海一恒科学仪器有限公司）；多功能酶标仪（型号：EIx800，美国BioTek公司）；核酸定量仪（型号：NanoVue plus，美国GE公司）；RT-qPCR仪（型号：MA-688，苏州雅睿生物技术股份有限公司）；电泳仪（型号：DYY-8C，北京六一生物科技有限公司）；半干转膜仪（型号：221BR，美国Bio-Rad公司）。

1.3 细胞培养

用含青霉素链霉素双抗的RPMI 1640培养基（加10%胎牛血清）在恒温37 ℃、饱和湿度、95% 空气+5%CO2的培养箱中培养A549细胞，每48 h更换1次培养基，细胞生长至80%～90%时传代，取传代5次后的对数生长期A549细胞进行实验。

1.4 CCK8实验检测细胞增殖活力

将A549细胞以5 000个/孔转移至96孔板，设对照组，Bre低、中、高剂量组和Bre+SKL2001组。培养24 h后，对照组更换新鲜无药培养基；Bre低、中、高剂量组分别更换含7.18、14.36、28.72 μmol/L Bre的培养基[前期研究结果显示，Bre对A549细胞半数抑制浓度（IC50）为14.36 μmol/L，本研究选择IC50作为Bre中剂量组药物浓度，Bre低、高剂量组药物浓度分别取IC50的0.5、2倍[6]]；Bre+SKL2001组更换含28.72 μmol/L Bre和20 μmol/L SKL2001的培养基。培养48 h后，10 μl/孔加入CCK8溶液，避光孵育2 h后通过酶标仪检测450 nm波长处吸光度值（A）。细胞增殖活力=（A给药组-A溶剂组）/（A对照组-A溶剂组）×100%。实验重复3次。

1.5 划痕实验检测细胞迁移率

将A549细胞以1×105个/孔转移至6孔板，待细胞生长至约90%时，用200 μl移液枪头划一条直线，按“1.4”项分组和给药干预48 h，分别于给药0 h和48 h拍照，迁移率=（0 h划痕宽度-48 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。实验重复3次。

1.6 Transwell实验检测细胞侵袭率

将Matrigel基质胶和培养基按1∶5混合后，100 μl/孔添加至Transwell上室，置于细胞培养箱待基质胶凝固后，将A549细胞以1×105个/孔转移至Transwell上室，培养24 h后，按“1.4”项分组，Transwell上室分别更换含相应浓度药物（同“1.4”项）的培养基，Transwell下室加RPMI 1640培养基，培养48 h后，用4%多聚甲醛固定Transwell下室细胞10 min，0.5%结晶紫染色20 min，PBS冲洗后通过光学显微镜观察并计数细胞。侵袭率=给药组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数×100%。实验重复3次。

1.7 RT-qPCR法检测细胞中MMP-2、MMP-9、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin、Snail、Wnt3a、β-catenin、GSK-3β mRNA表达

将A549细胞以1×105个/孔转移至6孔板，培养24 h后，按“1.4”项分组和给药干预48 h，吸弃培养基，加0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液进行消化后离心收集细胞，提取并测定总RNA浓度和纯度，反转录为cDNA，通过RT-qPCR试剂盒进行扩增反应，反应体系为20 μl（RT-qPCR预混液10 μl、cDNA 2 μl、正向引物0.8 μl、反向引物0.8 μl、反转录酶1 μl、无酶水5.4 μl）。反应条件：95 ℃预变性1 min，循环1次；95 ℃变性15 s、60 ℃延伸1 min，循环40次。以GAPDH为内参基因，运用2-ΔΔCt法计算目标mRNA相对表达水平。引物由生工生物工程（上海）公司设计与合成，引物序列见表1。实验重复3次。

表1 引物序列

基因名称引物序列（5’→3’）引物长度（bp）MMP-2109正向引物AGATACCCTTGACGTAAGG反向引物CCTCTCCAAGTCCATAGC MMP-9 95正向引物TGTACGCTATGGTACACTC反向引物GGCAGGACAGTTGCTCT N-cadherin107正向引物AGCCCAGACATCTGTGCC反向引物AACAGGGTCTCTATGCCC E-cadherin153正向引物ACCGAGAAGTTTCCACGTA反向引物CCTGTACGTGGTGGATGA Vimentin145正向引物GGGAAATTGCAGGAGGG反向引物TCCACTTTGCGTTCAAGG Snail139正向引物CTAATCCAGAGTTACCTCCAGC反向引物TTCCCACTGTCCTCTCTGA Wnt3a140正向引物ACGTCCAAGAAGAGCAAGC反向引物GGCACCTTGAAGTAGGTGTβ-catenin181正向引物CATCTACACAGTTGATGCCT反向引物GCAGTTTGTCAGTTCAGGA GSK-3β176正向引物GCAGCATGAAGTTAGCAGA反向引物GCGACCAGTTCTCCTGA GAPDH128正向引物CCTGACGCAACCAGTGC反向引物ATATCCTGCTGCTGACC

注 MMP：基质金属蛋白酶；GSK-3β：糖原合成激酶-3β。

1.8 Western blot法检测细胞中MMP-2、MMP-9、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin、Snail、Wnt3a、β-catenin、GSK-3β蛋白表达水平

将A549细胞以1×105个/孔转移至6孔板，培养24 h后，按“1.4”项分组和给药干预48 h，吸弃培养基，加0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液进行消化后离心收集细胞，加RIPA裂解液提取总蛋白，BCA测定浓度，按35 μg总蛋白量上样，10% SDS-PAGE电泳（浓缩胶：80 V、40 min；分离胶：120 V、60 min），转移至PVDF膜后用5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h，加1∶1 000的MMP-2、MMP-9、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin、Wnt3a、β-catenin、GSK-3β、Snail一抗稀释液和1∶3 000的GAPDH稀释液，4 ℃孵育过夜，PBS洗膜后加1∶4 000的IgG二抗稀释液，室温孵育1.5 h，PBS洗膜后加ECL显色，用Image J软件测定蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参进行目标蛋白表达半定量分析。实验重复3次。

1.9 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件对所得数据进行分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组A549细胞增殖活力比较

与对照组比较，Bre低、中、高剂量组A549细胞增殖活力降低（P＜0.05）。与Bre低剂量组比较，Bre中、高剂量组A549细胞增殖活力降低（P＜0.05）。与Bre中剂量组比较，Bre高剂量组A549细胞增殖活力降低（P＜0.05）。与Bre高剂量组比较，Bre+SKL2001组A549细胞增殖活力升高（P＜0.05）。见图1。

图1 各组A549细胞增殖活力比较（n=3）

2.2 各组A549细胞迁移率和侵袭率比较

与对照组比较，Bre低、中、高剂量组A549细胞迁移率和侵袭率降低（P＜0.05）。与Bre低剂量组比较，Bre中、高剂量组A549细胞迁移率和侵袭率降低（P＜0.05）。与Bre中剂量组比较，Bre高剂量组A549细胞迁移率和侵袭率降低（P＜0.05）。与Bre高剂量组比较，Bre+SKL2001组A549细胞迁移率和侵袭率升高（P＜0.05）。见图2。

图2 各组A549细胞迁移率和侵袭率比较

2.3 各组A549细胞MMP-2、MMP-9、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin、Snail、Wnt3a、β-catenin、GSK-3β mRNA表达量比较

与对照组比较，Bre低、中、高剂量组A549细胞GSK-3β mRNA表达量升高（P＜0.05）；Bre中、高剂量组A549细胞MMP-2、MMP-9、N-cadherin、Vimentin、Snail、Wnt3a、β-catenin mRNA表达量降低，E-cadherin mRNA表达量升高（P＜0.05）。与Bre低剂量组比较，Bre中、高剂量组A549细胞MMP-2、MMP-9、N-cadherin、Vimentin、Snail、Wnt3a、β-catenin mRNA表达量降低，E-cadherin、GSK-3β mRNA表达量升高（P＜0.05）。与Bre中剂量组比较，Bre高剂量组A549细胞MMP-2、MMP-9、N-cadherin、Vimentin、Snail、Wnt3a、β-catenin mRNA表达量降低，E-cadherin、GSK-3βmRNA表达量升高（P＜0.05）。与Bre高剂量组比较，Bre+SKL2001组A549细胞MMP-2、MMP-9、N-cadherin、Vimentin、Snail、Wnt3a、β-catenin mRNA表达量升高，E-cadherin、GSK-3β mRNA表达量降低（P＜0.05）。见图3。

图3 各组A549细胞MMP-2、MMP-9、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin、Snail、Wnt3a、β-catenin、GSK-3β mRNA表达量比较（n=3）

2.4 各组A549细胞MMP-2、MMP-9、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin、Snail、Wnt3a、β-catenin、GSK-3β蛋白表达水平比较

与对照组比较，Bre低、中、高剂量组A549细胞Snail蛋白表达水平降低（P＜0.05）；Bre中、高剂量组A549细胞MMP-2、MMP-9、N-cadherin、Vimentin、Wnt3a、β-catenin蛋白表达水平降低，E-cadherin、GSK-3β蛋白表达水平升高（P＜0.05）。与Bre低剂量组比较，Bre中、高剂量组A549细胞MMP-2、MMP-9、N-cadherin、Vimentin、Snail、Wnt3a、β-catenin蛋白表达水平降低，E-cadherin、GSK-3β蛋白表达水平升高（P＜0.05）。与Bre中剂量组比较，Bre高剂量组A549细胞MMP-2、MMP-9、N-cadherin、Vimentin、Snail、Wnt3a、β-catenin蛋白表达水平降低，E-cadherin、GSK-3β蛋白表达水平升高（P＜0.05）。与Bre高剂量组比较，Bre+SKL2001组A549细胞MMP-2、MMP-9、N-cadherin、Vimentin、Snail、Wnt3a、β-catenin蛋白表达水平升高，E-cadherin、GSK-3β蛋白表达水平降低（P＜0.05）。见图4。

图4 各组A549细胞MMP-2、MMP-9、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin、Snail、Wnt3a、β-catenin、GSK-3β蛋白表达水平比较

3 讨论

近年来，Bre抗肿瘤活性逐渐得到关注。既往研究证实，Bre对结直肠癌、子宫内膜癌等癌细胞增殖、迁移、侵袭具有抑制作用[11-12]。非小细胞肺癌包括腺癌、鳞癌、大细胞癌等亚型，其中肺腺癌占比最高，A549细胞则是肺腺癌的代表性模型[13]。本研究发现，Bre对A549细胞增殖具有抑制作用，这与Wei等[14]研究报道的Bre通过上调胰岛素样生长因子结合蛋白4表达而抑制A549细胞增殖的结果一致。

肿瘤细胞迁移、侵袭是原位肿瘤恶性转变的重要标志和患者死亡的主要原因。本研究发现，Bre能够降低A549细胞迁移率和侵袭率。在机制层面，细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是存在于细胞外间质中的大分子物质，构成复杂的网架结构，ECM异常降解是肿瘤细胞迁移、侵袭过程的关键步骤。以MMP-2、MMP-9为代表的基质金属蛋白酶是促进ECM降解的关键蛋白，临床研究表明通过降低MMP-2、MMP-9水平能够阻止非小细胞肺癌迁移、侵袭，提高患者治疗效果[15]。本研究发现，Bre能够降低A549细胞MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表达水平，这可能是Bre能够抑制A549细胞迁移和侵袭的重要机制。

EMT是紧密连接的上皮细胞转化为具有运动能力的间质细胞的过程，是肿瘤细胞能够迁移、侵袭的重要原因。N-cadherin、E-cadherin、Vimentin是EMT标志蛋白，EMT的发生伴随N-cadherin、Vimentin表达上调和E-cadherin表达下调[16]。本研究发现，Bre能够降低A549细胞N-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白表达水平并提高E-cadherin mRNA和蛋白表达水平，提示Bre能够抑制A549细胞EMT。在机制层面，N-cadherin和E-cadherin同属Ca2+依赖的细胞黏着糖蛋白，其中E-cadherin为上皮标志物，具有维持上皮细胞极性和紧密连接结构的作用，其表达水平与EMT及迁移侵袭呈负相关；N-cadherin为间质标志物，可导致细胞极性丧失和细胞间黏附减弱，促进细胞迁移和侵袭，其表达水平与EMT呈正相关[17]。Vimentin属于中间丝蛋白家族成员，是上皮细胞获得间质细胞表型和迁移侵袭能力的关键执行蛋白，具有促进EMT的作用。此外，本研究还发现Bre能够降低A549细胞Snail mRNA和蛋白表达水平。Snail是一种核转录因子，能够强力抑制E-cadherin表达而促进EMT，Chen等[18]研究报道Snail可作为抑制EMT的靶点。

Wnt/β-catenin是一条在肿瘤细胞迁移、侵袭、EMT等恶性进展过程中发挥关键调控作用的信号通路，倪明立等[8]报道非小细胞肺癌组织中Wnt/β- catenin信号通路相关蛋白表达水平显著高于正常肺组织中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平，并且其表达水平与患者中位生存期和预后呈负相关。有研究报道，Bre对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达及β-catenin核转位具有抑制作用[10]。本研究发现，Bre能够降低A549细胞中Wnt3a、β-catenin mRNA和蛋白表达水平，提高GSK-3β mRNA和蛋白表达水平，提示Bre对A549细胞迁移、侵袭、EMT的抑制作用可能与下调Wnt/β-catenin信号通路有关。在机制层面，Wnt配体缺失时，胞浆内β-catenin被GSK-3β与腺瘤性结肠息肉病蛋白（adenomatous polyposis protein，APC）、酪氨酸蛋白激酶1α（casein kinase 1α，CK1α）形成的复合物诱导磷酸化后降解，因此GSK-3β对Wnt/β-catenin信号通路具有抑制作用。以Wnt3a为代表的Wnt配体可抑制GSK-3β活性，破坏GSK-3β/APC/CK1α复合物结构，导致胞浆内β-catenin蓄积并向胞核内转移，β-catenin入核后诱导MMP-2、MMP-9、Vimentin、Snail等转录表达而促进细胞迁移、侵袭和EMT[19-20]。此外，本实验设置Bre（高剂量）+SKL2001组，结果显示，与Bre高剂量组比较，Bre+SKL2001组对各项检测指标的作用明显减弱，从而进一步证实Bre对A549细胞迁移、侵袭、EMT的抑制作用与其下调Wnt/β-catenin信号通路有关的推论。

本研究采用A549细胞揭示了Bre能够通过Wnt/β-catenin信号通路抑制EMT，但本研究仍存在一定的局限性：①未涉及动物体内实验验证；②仅在肺腺癌A549细胞中进行探讨，未阐明Bre是否对肺鳞癌、大细胞癌等其他非小细胞肺癌亚型EMT具有抑制作用。

综上所述，Bre具有抑制A549细胞迁移、侵袭和EMT的作用，其机制可能与下调Wnt/β-catenin信号通路有关。本研究初步证实Bre具备作为非小细胞肺癌中肺腺癌亚型治疗药物的潜能，并为其临床诊疗及新药探索研究提供了新的思路。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Effects and mechanism of breviscapine on migration, invasion, and epithelial-mesenchymal transition in non-small cell lung cancer A549 cells

WEI Hui WANG Tianheng GAO Shiqi

Department of Pharmacy, Handan First Hospital, Hebei Province, Handan 056002, China

[Abstract] Objective To investigate the effects and possible mechanisms of breviscapine (Bre) on migration, invasion,and epithelial-mesenchymal transition (EMT) in non-small cell lung cancer A549 cells. Methods The A549 cells were divided into control group, Bre low, medium, high dose group and Bre+SKL2001 (Wnt/β-catenin signaling pathway agonistor) group. After 48 h of intervention with medication, the cell proliferation activity was detected by CCK8 assay,cell migration rate was detected by scratch assay, cell invasion rate was detected by Transwell assay. The expression of matrix metalloproteinase (MMP)-2, MMP-9, N-cadherin, E-cadherin, Vimentin, Snail, Wnt3a, β-catenin, and glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) mRNA and proteins were detected by RT-qPCR or Western blot. Results Compared with the control group, the proliferation activity, migration rate, and invasion rate of A549 cells in the Bre low, medium, high dose groups were decreased (P＜0.05). Compared with the Bre high dose group, the proliferation activity, migration rate,and invasion rate of A549 cells in the Bre+SKL2001 group were increased (P＜0.05). Compared with the control group,the expression levels of GSK-3β mRNA in A549 cells of the Bre low, medium, high dose groups were increased (P＜0.05); the expression levels of MMP-2, MMP-9, N-cadherin, Vimentin, Snail, Wnt3a, β-catenin mRNA in A549 cells of the Bre medium, high dose groups were decreased, and the expression level of E-cadherin mRNA was increased (P＜0.05). Compared with the Bre high dose group, the mRNA expression levels of MMP-2, MMP-9, N-cadherin, Vimentin,Snail, Wnt3a, and β-catenin in A549 cells of the Bre+SKL2001 group were increased, while the mRNA expression levels of E-cadherin and GSK-3β were decreased (P＜0.05). Compared with the control group, the expression levels of Snail protein in A549 cells of the Bre low, medium, high dose groups were decreased (P＜0.05). The expression levels of MMP-2, MMP-9, N-cadherin,Vimentin, Wnt3a, β-catenin proteins in A549 cells of the Bre medium, high dose groups were decreased, while the expression levels of E-cadherin and GSK-3β proteins were increased (P＜0.05). Compared with the Bre high dose group, the expression levels of MMP-2, MMP-9, N-cadherin, Vimentin, Snail, Wnt3a, and β-catenin proteins in A549 cells of the Bre+SKL2001 group were increased, while the expression levels of E-cadherin and GSK-3β proteins were decreased (P＜0.05). Conclusion Bre has the inhibitory effects on the migration, invasion, and EMT of non-small cell lung cancer A549 cells, which mechanism may be related to the down-regulation of the Wnt/β-catenin signaling pathway.

[Key words] Non-small cell lung cancer; Breviscapine; Migration; Invasion; Epithelial-mesenchymal transition; Wnt/β-catenin signaling pathway

[中图分类号] R734.2；R285.5

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）05（b）-0028-08

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25101352

[基金项目] 河北省医学科学研究课题（20220506）。

[作者简介] 韦辉（1986.11-），女，硕士，副主任中药师；研究方向：药理学与临床药学。

（收稿日期：2025-10-21）

（修回日期：2026-01-18）