棘球蚴病根据病原体不同，可分为由多房棘球绦虫虫卵感染引起的泡型包虫病和由细粒棘球绦虫虫卵感染引起的囊型包虫病[1]。在中国，该病被列为重点防治寄生虫病之一。主要在西北地区流行，以新疆、西藏、宁夏、甘肃，青海等最为严重[2]。中国政府已大力加强对包虫病的防控力度，但在新疆仍有20%~90%绵羊被感染[3]。泡型棘球蚴以浸润增殖为主要生长方式，可侵犯邻近器官，也可转移至肺、脑、骨骼等形成转移性病灶，从而危及患者生命，故其也被称作“虫癌”[4]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雌鼠（7～8 周，体质量80～100 g）。实验鼠购自江苏青龙山生物科技有限公司，实验动物生产许可证号：[SCXK（苏）2024-0001]，实验动物使用许可证号：SYXK（青）2020-0001，实验动物合格证编号：B202506050595。该研究已经获得青海大学动物伦理委员会的批准（P-SL-2024-319）。

1.1.2 主要试剂和仪器 人单核细胞白血病细胞（货号：TCH-C361）购自苏州海星生物科技有限公司；提取人外周血中性粒细胞的试剂盒（货号：P9040）购自北京索莱宝科技有限公司；RPMI-1640培养基（货号：PYG0006）与青霉素-链霉素混合液（双抗）（货号：Pyg0016）购自武汉普诺赛生命科技有限公司。抗H3Cit抗体（货号：24XD085F03）、抗MPO抗体（货号：A36178）及PE anti-human CD86 Antibody（货号：374205）、APC anti-human CD163 Antibody（货号：333609）、FITC anti-human CD11b Antibody（货号：301329）、PE Human CD66b（货号：392903）等一抗，以及CY3 Conjugated AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG （H+L）（货号：BA1032）、DyLight 488 Conjugated AffiniPure Goat Anti-mouse lgG（H+L）（货号：BA1126）等二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司；PMA（货号：HY-18739）购自美国Med chem express公司，抗荧光淬灭剂（货号：CR2410115）购自北京索莱宝科技有限公司；PI染色液（货号：R20287）购自上海源叶生物科技有限公司；DNA提取试剂盒（货号：B0806A）购自北京天根科技有限公司；Sytox Green的核酸染料（货号：RR820A）购自美国Thermo Fisher公司；Piko Green ds-DNA定量检测试剂盒（货号：AN54L038）购自上海和元李记生物科技有限公司。LightCycler®480Ⅱ型PCR基因扩增仪购自瑞士Roche公司；FACSCelesta™流式细胞仪购自美国BD公司；LSM880激光共聚焦显微镜购自德国ZEISS公司。

1.2 实验方法

1.2.1 THP-1细胞的培养 将THP-1细胞培养于含1%双抗和10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中，在37 ℃，5% CO2的条件下在培养箱中进行培养，期间每隔2～3 d使用半换液法更换完全培养基，当细胞处于对数生长期时，按照1∶3的比例对细胞进行计数与传代。

1.2.2 建立THP-1细胞的极化模型 用巴氏吸管吸取2 ml THP-1的细胞悬液，将密度为5×105个/孔的细胞悬液加入6孔细胞培养板中，根据实验要求步骤如下：①在仅接种THP-1细胞的培养基中，添加每孔100 ng/ml的PMA，培养箱中孵育24 h，诱导分化为M0型巨噬细胞，光学显微镜下观察细胞形态表现，此时细胞为贴壁状态[5]。②然后在M0型巨噬细胞培养基里，加入20 ng/ml的γ干扰素和100 ng/ml的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），培养箱中孵育48 h，使其向M1表型分化[6]。

1.2.3 流式细胞术鉴定M1型巨噬细胞 用含预冷磷酸盐缓冲液的15 ml EP管将已经成功分化的M1型巨噬细胞重悬收集，离心（1 000 r/min，3 min，离心半径15 cm），弃去上清液，设置对照组（仅有THP-1细胞）、CD11b组（THP-1细胞+100 ng/ml PMA刺激24 h）、CD86组（THP-1细胞+100 ng/ml PMA+20 ng/ml γ干扰素+100 ng/ml LPS刺激48 h）。然后在100 ml的预冷磷酸盐缓冲液中，加入含有0.5 μg的CD11b抗体（FITC标记）和0.5 μg CD86抗体（APC标记）重悬细胞，在冰上（4 ℃）避光孵育30 min后，通过流式细胞仪检测巨噬细胞表面CD11b和CD86的荧光表达强度，实验独立重复3次。

1.2.4 多房棘球蚴原头节（protoscolex，PSC）的分离和提取 自青海大学附属医院中心实验室的沙鼠中提取多房棘球蚴PSC。方法：将造模时间为3个月以上的沙鼠经吸入异氟烷（瑞沃德生命科技有限公司，生产批号：20101601）深度麻醉后脱颈处死，其体表需经75%乙醇浸泡消毒5～10 min。置于超净工作台内，用眼科剪小心地剪开沙鼠的腹腔，然后用镊子轻柔地剥离多房棘球蚴的病灶组织，分离出来的组织置于含少量预冷磷酸盐缓冲液的培养皿中。病灶组织块经由机械剪碎、研磨后，将组织匀浆反复通过300目的细胞筛过滤，滤液静置3～5 min后，将滤液的沉淀用磷酸盐缓冲液重悬洗涤5～7次，直至上清液澄清。最终将沉淀用含20%胎牛血清的预热RPMI-1640培养基重悬，并置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。通过PI染色法测定多房棘球蚴PSC存活率。多房棘球蚴PSC存活率=活PSC个数/（活PSC个数+死亡PSC个数）×100%。

1.2.5 中性粒细胞（neutrophils，NEU）的提取与提纯 健康人外周血使用柠檬酸钠抗凝管采集。首先将6 ml的NEU分离液加到15 ml离心管里，然后将3 ml全血缓慢加于分离液上层，使血液与分离液细胞形成清晰的分层界面。随后在离心（1 000 g，30 min，离心半径6.6 cm），用巴氏吸管小心环绕地吸取NEU层，并将其转移至新的15 ml EP管中，加入细胞洗涤液重悬洗涤离心（250 g，10 min，离心半径6.6 cm）。弃上清液后，再加入5 ml红细胞裂解液，重悬混匀，于冰上（4 ℃）避光裂解15 min。裂解后继续以细胞洗涤液后离心（250 g，10 min，离心半径6.6 cm）。弃上清液后，重复2次以上操作。最后，弃尽上清，将NEU沉淀用含10% 胎牛血清的预热RPMI-1640培养基重悬NEU，计数后置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2.6 检测NEU纯度 把提取出来的NEU以5×105个离心（250 g，10 min，离心半径6.6 cm）后弃去上清液，洗涤离心（250 g，10 min，离心半径6.6 cm）后，再用100 μl预冷的磷酸盐缓冲液将细胞沉淀重悬，并加入按1∶500的比例稀释的PE-CD66b荧光抗体，分别设置空白对照组（仅有NEU）与PE-CD66b组（NEU+PE-CD66b荧光抗体）。避光、4 ℃孵育30 min后，预冷磷酸盐缓冲液洗涤后用300 μl 磷酸盐缓冲液重悬NEU细胞，以流式细胞仪鉴定NEU的纯度，实验独立重复3次。

1.2.7 NETs的免疫荧光检测 将多聚赖氨酸包被的细胞爬片置于24孔板中，把NEU以5×105个/孔的密度接种于24孔板上，放入37 ℃、5%CO2培养箱中培养1～2 h，使其充分贴壁。随后，分别对各组进行处理，阳性对照组：在NEU中加入100 nmol/L的PMA刺激3 h；实验组：用NEU与500只多房棘球蚴PSC共孵育5 h可成功诱导出NETs[7]；阴性对照组仅含NEU。处理结束后，弃去上清液，用磷酸盐缓冲液轻柔清洗细胞，并用4%多聚甲醛溶液于室温固定20 min。固定完成后，弃去固定液，用磷酸盐缓冲液清洗3次后以0.5%Triton X-100的曲拉通室温通透20 min，弃通透液，用磷酸盐缓冲液清洗3次后用含10%BSA的封闭液室温封闭1 h，弃封闭液后加入抗MPO荧光抗体（1∶500）、H3Cit荧光抗体（1∶500）过夜孵育（4 ℃，避光）后，用磷酸盐缓冲液清洗3次后加入二抗室温孵育1 h，细胞爬片经常温磷酸盐缓冲液洗涤3次，以含DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片后，实验独立重复3次。进行荧光显微镜观察是否形成NETs。

1.2.8 M1型巨噬细胞、多房棘球蚴PSC和NETs共孵育 将处于对数生长期的THP-1细胞以约1×105个/孔的密度接种于6孔板中，使用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基培养。首先加入100 ng/ml的PMA诱导24 h，使其分化为贴壁的M0型巨噬细胞；弃去培养基后用磷酸盐缓冲液轻柔洗涤，更换为含20 ng/ml的γ干扰素与100 ng/ml的LPS的培养基继续诱导48 h，以获得成熟的M1型巨噬细胞。随后将细胞随机分为4组进行共培养处理：①对照组（仅接种M1巨噬细胞）；②M1+NETs组（与NETs共孵育）；③M1+PSC组（与PSC共培养）；④M1+NETs+PSC组（同时与NETs、PSC共培养）。所有组别分别于共培养6、48 h后收集细胞，用于后续RT-qPCR分析。诱导与共培养期间定期于显微镜下观察细胞形态变化。

1.2.9 RT-qPCR法检测共孵育后MRC1、CD206、CD163、ARG1、白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）的mRNA表达量 采用Trizol法提取巨噬细胞总RNA，浓度测定后使用TaKaRa反转录试剂盒合成cDNA。采用SYBR Green qPCR法进行检测，反应体系为20 μl，含5×FastKing-RT SuperMix 4 μl、总RNA 50 ng~2 μg，以RNase-Free ddH2O补足体积。反应程序为：42 ℃，15 min（去除gDNA及cDNA合成）；95 ℃，3 min（酶失活）。所得cDNA用于qPCR，反应体系20 μl，含TB Green Premix Ex Taq 10 μl、正反向引物各0.4 μl、cDNA模板4 μl，DEPC水补足。目标基因相对表达以ACTB为内参，采用2-△△Ct法计算，实验重复3次，人核基因组MRC1、CD163、IL-10、ARG1，其用于qPCR扩增的特异性引物序列见表1。

表1 核基因组引物序列

基因名称引物序列（5’→3’）引物（b长p）度MRC1正向引物：TTCAGTGGACCATCGAGGAAGAGG24反向引物：ATGGCAACACACCCTGGCTTTC22 CD163正向引物：GCCACAACAGGTCGCTCATCC21反向引物：GCAAGCCGCTGTCTCTGTCTTC22 IL-10正向引物：GACATCGCTGAGAACCAAGACCCA24反向引物：AAAGGCATTCTTCACCTGCTCCAC24 ARG1正向引物：ACTTAAAGAACAAGAGTGTGATGTG25反向引物：CGCTTGCTTTTCCCACAGAC20 ACTB（内参）正向引物：ATTGCCGACAGGATGCAGAA20反向引物：CGGACTCGTCATACTCCTGC20

注 IL-10：白细胞介素-10。

1.3 统计学方法

所有数据均采用GraphPad Prism 10.0软件进行统计分析。计量资料以均值±标准差（）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人源M1型巨噬细胞构建

在显微镜下观察，悬浮THP-1细胞为体积较小的透亮圆形悬浮细胞，与PMA共同孵育24 h后贴壁，部分呈梭形，为形状不规则的人源M0型巨噬细胞。PMA诱导后的M0型巨噬细胞，继续以100 ng/ml的LPS和20ng/ml γ干扰素刺激48 h诱导其向M1型巨噬细胞极化。与LPS和γ干扰素共同孵育48 h后贴壁增多，体积增大，伪足延长，大多呈梭形，为形状不规则的人源M1巨噬细胞。见图1。

图1 不同细胞因子刺激后THP-1细胞显微镜下的形态变化（×20）

2.2 M1型巨噬细胞鉴定

与对照组比较，CD11b组阳性率达到81.6%，CD86组阳性率达到96.0%（P＜0.05）。实验结果显示，THP-1细胞成功分化为M1型巨噬细胞。见图2。

图2 巨噬细胞的阳性表达率

2.3 多房棘球蚴PSC的分离情况与存活率

PI染色结果显示，所获取PSC的存活率约94%，存活率＞90%，满足后续所需实验条件。见图3。

图3 PI染色后的多房棘球蚴原头节（×100）

2.4 NEU纯度

从健康人外周血成功分离出的NEU，经PE-CD66b荧光抗体标记和流式细胞术鉴定后，与空白对照组比较，PE-CD66b组的NEU纯度达到99.7%（P＜0.05），该高纯度确保了后续实验的可靠性。见图4。

图4 中性粒细胞纯度

2.5 免疫荧光法检测NETs的形成情况

仅有NEU的阴性对照组无明显NETs产生，而NEU经PMA处理的阳性对照组和PSC与NEU共培养的实验组中，均检测到由MPO（绿色）和H3Cit（红色）共定位形成的典型NETs结构。定量分析显示，阳性对照组和实验组的MPO与H3Cit荧光强度均高于阴性对照组（P＜0.05）。见图5。

图5 NETs的形成情况

2.6 RT-qPCR检测M2相关炎症因子CD206（MRC1）、CD163、ARG1、IL-10的mRNA表达水平

在6、48 h时，与对照组比较，M1+NETs+PSC组MRC1、CD163、ARG1、IL-10 mRNA表达量均增加（P＜0.05）；在6 h时，与对照组比较，M1+NETs组ARG1、IL-10 mRNA表达量增加（P＜0.05）；在48 h时，与对照组比较，M1+NETs组与M1+PSC组IL-10 mRNA表达量增加（P＜0.05）。与6H-M1+NETs+PSC组比较，48H-M1+NETs+PSC组MRC1、CD163、ARG1、IL-10 mRNA表达量均增加（P＜0.05）。见图6。

图6 M2型巨噬细胞标志物mRNA的表达情况（n=8）

3 讨论

本研究通过体外实验证实，NETs可时间依赖性地促使M1型巨噬细胞向M2型极化，提示其不仅具有直接抗寄生虫作用，还可能在调控后续免疫应答中发挥关键作用，为理解多房棘球蚴的免疫调节机制提供了新思路。NEU是最丰富的循环白细胞，是先天免疫和获得性免疫的重要组成部分可通过形成NETs等方式清除病原体[8-13]。随着多房棘球侵入宿主，在感染早期可观察到大量NEU被募集至病灶周边[14]。与其他的免疫细胞共同构成复杂的炎症浸润带，该浸润带是宿主与病原体相互作用的区域之一[15]。有研究认为NETs主要通过其物理结构及抗菌成分直接发挥捕获和杀伤病原体的作用，而本研究提示NETs还具有重要的免疫调节功能。例如，已有研究表明NETs能够影响THP-1细胞的极化方向[16]；NETs已被证实是宿主免疫防御的重要组成部分[17]；NETs具有广谱微生物捕获能力，并能有效抵御寄生虫感染。其前期工作显示，多房棘球蚴病患者外周血NEU与淋巴细胞比值显著增高[18]。这与本研究结果一致，本研究进一步揭示，在寄生虫感染模型中，NETs可能通过驱动巨噬细胞向M2表型极化，协助寄生虫实现免疫逃逸。

巨噬细胞具有高度可塑性，可极化为经典活化的M1型或替代活化的M2型[19]。绦虫感染早期以Th1/M1型免疫反应为主，后期则向Th2/M2主导的免疫调节和组织修复表型转变[20-24]。M1型巨噬细胞通过分泌促炎性细胞因子清除病原体，而M2型则主要发挥抗炎、免疫调节与组织修复作用[25-28]。本研究观察到NETs驱动M2极化，为理解多房棘球蚴如何操控这一极化转换提供了新线索。肝巨噬细胞在宿主防御多房绦虫感染中发挥关键作用，其早期募集或有助于清除寄生虫，目前，阿苯达唑为临床上最主要的棘球蚴病治疗药物，但疗效有限，巨噬细胞是调控宿主抵御蠕虫感染免疫应答的关键细胞[22,29-30]。前期研究表明，豆状囊尾蚴来源的let-7-5p能够通过抑制靶基因C/EBPδ的表达，驱动巨噬细胞向M2表型极化[31]。分析表明，多房棘球蚴与豆状囊尾蚴的let-7-5p序列完全一致，提示多房棘球蚴来源的emu-let-7-5p可能同样通过调控C/EBPδ影响巨噬细胞极化[32]。也有研究报道，多房棘球蚴及其外泌体中均含有高丰度且相对富集的emu-let-7-5p[33]。本研究提示，靶向NETs形成或其介导的巨噬细胞极化信号，或可成为干预多房棘球蚴免疫逃逸的新策略。例如，特异性抑制病灶局部促M2极化的NETs，可能逆转免疫抑制微环境，增强宿主对寄生虫的清除能力，为联合免疫治疗提供新思路。多房棘球蚴病严重损伤人体健康、影响经济发展[34]。

本研究存在一定的不足。首先，体外共培养体系难以完全模拟体内复杂的免疫微环境。其次，本研究结果主要基于mRNA水平，尚需在蛋白水平进一步验证M2型标志物的表达及机制。此外，结论尚未在动物模型中经过体内验证。基于此，未来的研究方向有：①在PSC感染模型中，通过干预NETs形成，验证其在体内对巨噬细胞极化及疾病进展的作用；②鉴定NETs调控巨噬细胞M2极化的关键受体与信号通路等。

综上所述，本研究发现NETs、PSC和M1巨噬细胞共培养可时间依赖性地促进巨噬细胞M2型极化，提示NETs在感染微环境中具有免疫调控作用，其机制可能与PSC等间接效应相关，其具体机制有待进一步研究。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Study on the role and mechanism of neutrophil extracellular traps in macrophage polarization within the microenvironment of hepatic alveolar Echinococcus multilocularis infection

DENG Jiawen1 REN Li2

1.School of Clinical Medicine, Qinghai University, Qinghai Province, Xining 810003, China; 2.Department of General Surgery, Affiliated Hospital of Qinghai University, Qinghai Province, Xining 810001, China

[Abstract] Objective To investigate the effect of neutrophi l extracellular traps (NETs) on the polarization of macrophage phenotype in Echinococcus multilocularis infection. Methods In this study, THP-1 cells were induced into M1-type macrophages using interferon-γ combined with lipopolysaccharide (LPS) and PMA. The cells were divided into the control group (only THP-1 cells), the CD11b group (THP-1 cells + 100 ng/ml PMA stimulation for 24 hours), and the CD86 group (THP-1 cells + 100 ng/ml PMA + 20 ng/ml interferon-γ + 100 ng/ml LPS stimulation for 48 hours). Their phenotypes were identified using flow cytometry. Echinococcus multilocularis protoscolex (PSC) were extracted and the PI staining method was used to detect its survival rate. Using the gradient centrifugation method, neutrophils (NEU) were isolated from the peripheral blood of healthy volunteers, and divided into a blank control group (only NEU), and a PE-CD66b group (NEU + PE-CD66b fluorescent antibody). The purity of these cells was verified by flow cytometry. The expression of NETs markers of citrullinated histone H3 (H3Cit) and myeloperoxidase (MPO), was determined by immunofluorescence in the groups: positive control group (NEU + 100 nmol/L PMA stimulation for 3 hours), negative control group (only NEU inoculation), and experimental group (500 pieces of Echinococcus multilocularis PSC and NEU cocultured for 5 hours). The Echinococcus multilocularis PSC, M1 macrophages and NETs were co-cultured in vitro, forming four groups: the control group (only inoculated with M1 macrophages), the M1+NETs group, the M1+PSC group and the M1+NETs+PSC group. RT-qPCR was used to detect the mRNA expression levels of M2-related inflammatory factors [CD206, CD163, ARG1, interleukin-10 (IL-10)] at different time points (6 and 48 hours). Results Compared with the control group, the positive rate in the CD11b group reached 81.6%, and the positive rate in the CD86 group reached 96.0% (P＜0.05). The results of PI staining showed that the survival rate of the obtained Echinococcus multilocularis PSC was greater than 90%. NEU was successfully isolated from the peripheral blood of healthy individuals. After being labeled with PE-CD66b fluorescent antibody and identified by flow cytometry, compared with the blank control group,the purity of the PE-CD66b group reached 99.7% (P＜0.05). The expression of NETs in the negative control group, positive control group, and experimental group was identified by immunofluorescence. NETs showed a typical reticular structure. The co-localization signal of MPO and H3Cit in the experimental group was significantly higher than that in the negative control group (P＜0.05). The results of RT-qPCR showed that at 6 and 48 hours, compared with the control group, the mRNA expression levels of MRC1, CD163, ARG1, and IL-10 in the M1+NETs+PSC group were all increased(P＜0.05). At 6 hours, compared with the control group, the mRNA expression levels of ARG1 and IL-10 in the M1+NETs group were increased (P＜0.05). At 48 hours, compared with the control group, the mRNA expression levels of IL-10 in both the M1+NETs group and the M1+PSC group were increased (P＜0.05). Compared with the 6 H-M1+NETs+PSC group, the mRNA expression levels of MRC1, CD163, ARG1, and IL-10 in the 48 H-M1+NETs+PSC group were all increased (P＜0.05). Conclusion In the microenvironment of Echinococcus multilocularis infection, NETs can promote the time-dependent polarization of M1-type macrophages to the M2 phenotype, suggesting that NETs may play an important role in the immune regulation process of multi-echinococcal cysts.

[Key words] Echinococcus multilocularis protoscoleces; Neutrophils; Neutrophil extracellular traps; THP-1 cells; M1-type macrophages

[中图分类号] R532.32

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）05（b）-0063-08

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25101878

[基金项目] 青海省科技计划项目（2019-ZJ-7031）；青海省“昆仑英才”行动计划项目（青人才字〔2024〕1号）。

[作者简介]

邓嘉雯（1998.6-），女，青海大学临床医学院2023级外科学专业在读硕士研究生，主要从事肝多房棘球蚴基础研究工作。

[通讯作者] 任利（1976.10-），男，硕士，教授，主任医师，博士生导师；研究方向：胆胰疾病的内镜微创治疗，超声内镜诊断及治疗。

（收稿日期：2025-10-27）

（修回日期：2026-01-10）