肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是肾实质泌尿小管上皮系统中最常见的恶性肿瘤之一，占肾脏恶性肿瘤的80%～90%[1]。GLOBOCAN2020全球癌症统计数据显示，全球肾癌新发病例43.1万例，肾癌患者死亡197万例[2]。2022年中国肿瘤登记数据显示肾癌新发病例为7.37万例[3]。约有30%的患者首次诊断为转移性肾癌，5年生存率低至10%[4]。虽有靶免联合治疗，但价格昂贵且不良反应和耐药性问题不容忽视。

二仙汤是张伯讷教授针对肾精不足、相火偏旺的更年期患者研制出的方剂，后经多年临床实践将二仙汤作为治疗肾癌的基础方[5-6]。现代药理研究证明二仙汤有调节免疫、抗肿瘤的作用[7]。三仙胶囊在二仙汤基础上加入浙贝母、苦参、薏苡仁、莪术、仙鹤草、八月札、白花蛇舌草，具有滋补阴阳、祛邪抗癌的作用。经临床证实可以改善症状、防止复发转移[8]。

上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是肾癌转移核心机制[9]。研究表明，EMT与肾癌的转移与侵袭能力紧密相关[10-12]；EMT调控肾癌细胞迁移并形成新的肿瘤灶[13]；EMT过程受到细胞内多种信号通路的高度调控[14-16]。PDGF能诱导多种下游信号蛋白的表达诱导EMT，PDGFD目前已被检测到在多种癌症细胞中表达上调，但对肾癌相关研究工作鲜见报道[17-18]。本研究探讨三仙胶囊能否调控PDGFD来影响肾癌的增殖迁移及EMT进程，旨在为肾癌的治疗提供新理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

SPF级SD雄性大鼠30只，体质量250 g左右，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2024-0003，实验动物使用许可证号：SYXK（晋）2020-0003，实验动物合格证号：No.110322251100661683。实验已通过山西省中医药研究院医学伦理委员会审查批准（SZYLY2025KY-0321）。人肾透明细胞腺癌细胞株786-O（编号：TCH-C107）购于苏州海星生物科技有限公司。

1.2 主要仪器与试剂

Axio Observer 3 倒置荧光显微镜（德国卡尔·蔡司股份公司）；C-1150酶标仪（德国Leica公司）；Bio-rad蛋白电泳系统电泳仪（美国ProteinSimple公司）；Tanon 2500凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）；Heracell 150i二氧化碳培养箱（美国赛默飞世尔科技公司）；QuantStudio 5荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；SC-3610低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；-80 ℃超低温冰箱（美国赛默飞世尔科技公司）；YXQ-LS-50G高温灭菌锅（常州恒隆仪器有限公司）；三仙胶囊由山西省中医院药房提供（晋药制字AZ20080244，生产批号：202401191）。胎牛血清（货号：KY-01002，安徽康源生物技术有限责任公司）；RPMI-1640培养基、青霉素-链霉素溶液、PBS（货号：C11875500BT、15140122、10010023，美国Gibco公司）；胰蛋白酶-EDTA消化液（货号：T1300，北京索莱宝科技有限公司）；HyCyteTM冻存液（货号：GUCP-R201，苏州海星生物科技有限公司）；CCK8试剂盒、结晶紫染色液、TRNzol总RNA提取试剂[货号：DP424、G1063、R1100，天根生化科技（北京）有限公司]；Transwell小室（货号：725431，无锡耐思生命科技股份有限公司）；4%多聚甲醛固定液、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：P0099、P0013、P0010S，上海碧云天生物技术股份有限公司）；PDGFD、PDGFR-β、E-cadherin、N-cadherin、Snail、Vimentin抗体、β-actin鼠单抗（货号：YT5299、YM8413、YT1454、YT2988、YM8754、YM8324、YM3028，美国Immunoway公司）；过表达慢病毒由上海吉玛制药技术有限公司完成。

1.3 实验分组及处理

1.3.1 实验分组 将786-O细胞分为空白对照组（常规培养）、三仙胶囊组（20%的三仙胶囊含药血清进行培养）、三仙胶囊+PDGFD过表达组（转染PDGFD后用20%的三仙胶囊含药血清进行培养）、PDGFD过表达组（转染PDGFD后常规培养）。

1.3.2 稳转细胞株构建和RT-qPCR法验证转染效率 慢病毒的构建和包装由上海吉玛制药技术有限公司承包，基因名称PDGFD（GeneID：80310），物种：Human，过表达载体名称：Lv5（EF-1a/GFPhe&Puro）。取对数生长期的786-O细胞以2×105个/孔接种于6孔板中，细胞汇合度为30%时加入对应感染复数（multiplicity of infection，MOI）的病毒液（预实验得出最佳感染复数值MOI=5），感染过表达（PDGFD过表达组）和对照空载慢病毒（空载组），嘌呤霉素筛选出稳定感染细胞株。采用RT-qPCR法检测PDGFD基因的相对表达量，验证慢病毒转染效率。

1.3.3 制备含药血清 将大鼠完全随机分成空白组、三仙胶囊组各15只。适应性喂养7 d后称重，每日上午以542 mg/（kg·d）剂量灌胃1.5 ml[19]。第6次灌胃结束禁食12 h，第7天早灌胃后1 h取血。将采血管室温下静置2 h，4 ℃，转速3 000 r/min，离心半径15 cm，离心20 min。收集血清，56 ℃水浴锅中灭活30 min，超净台中用0.22 μm滤器过滤，分装保存放置-80 ℃冰箱保存。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 最佳含药血清浓度和干预时间筛选 将786-O细胞以5×103个/孔，200 μl/孔的密度接种在96孔板中，培养24 h后吸弃培养基，分别加入0%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%、17.5%、20.0%浓度的含药血清的基础培养基（血清总体积20%，不足用空白血清补齐），分别培养24 h和48 h，每组设置5个复孔[20]。吸弃培养基后每孔加入100 μl CCK8工作液，在培养箱中孵育1 h，用酶标仪测量450 nm波长处的光密度（optical density，OD）值，实验重复3次。

1.4.2 CCK8实验 将上述分组细胞以1×103个/孔，200 μl/孔接种在96孔板，每组设置3个复孔，待细胞贴壁后，分别给予上述给药方式进行换液后分别培养0、24、48、72、96 h。吸弃培养基后每孔加入100 μl CCK8工作液，在培养箱孵育1 h，用酶标仪测量450 nm波长处的光密度OD值，实验重复3次。

1.4.3 平板克隆实验 将上述分组细胞以500个/孔，2 ml/孔接种在6孔板中，每组设置3个复孔，待细胞贴壁后，分别以上述给药方式培养9~11 d，3 d左右换1次液，＞50个细胞的克隆团被认为是1个克隆，用4%多聚甲醛固定15 min，0.1%结晶紫溶液染色30 min，用PBS冲洗，干燥后拍照并用Image J软件计数，实验重复3次。

1.4.4 划痕愈合实验 将上述分组细胞以1×105个/孔，2 ml/孔接种在6孔板中，每组设置3个复孔，待细胞密度汇合至80%～90%时，用200 μl枪头进行垂直划线，用PBS清洗2次，记为0 h并拍照，拍照后分别加入上述分组中的培养基继续培养12、24 h后，在显微镜下观察并拍照，用Image J软件测量划痕的宽度，并计算细胞迁移率，实验重复3次。

1.4.5 Transwell实验 将细胞用无血清培养基培养24 h后重悬，以1×106个/孔，在小室上室加入100 μl细胞悬液，下室加入600 μl不同干预条件的完全培养基，每组设置3个复孔，取出24孔板，吸弃小室多余培养基，24孔板加入4%多聚甲醛固定20 min。加入0.1%结晶紫染色30 min。使用棉签轻柔地擦拭除去上层未迁移的细胞，用PBS将多余浮色洗掉。晾干后进行拍照并统计迁移细胞数量。细胞侵袭实验要预先在上室底部铺60 μl基质胶培养箱孵育过夜，再进行上述处理，实验重复3次。

1.4.6 Western blot法 取上述分组细胞分别以不同干预条件培养24 h后用RIPA裂解液提取蛋白。BCA法进行蛋白定量，各组取等量进行电泳，将蛋白转移至0.45 μm孔径NC膜（300 mA，2 h），将膜完全浸没3%BSA-TBST中室温轻摇30 min，与特异性一抗PDGFD、PDGFR-β、E-cadherin、N-cadherin、Snail、Vimentin（1∶1 000）4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次，与二抗山羊抗兔IgG（H+L）HRP（1∶10 000）室温轻摇40 min。用TBST洗膜6次，将膜放在成像仪的托盘上，滴加ECL发光液，拍照。采用Image J软件分析各组蛋白条带的灰度值，用目的蛋白与内参蛋白β-actin灰度值的比值作为该蛋白的相对表达量，实验重复3次。

1.4.7 RT-qPCR法 收集上述分组细胞，使用RNA提取试剂盒提取总RNA，进行RNA质量测定，反转录合成cDNA，反转录条件：50 ℃孵育15 min，75 ℃孵育5 min，终止反应。反转录RT-qPCR反应体系（20 μl）：10 μl 2×BlazeTaq™SYBR® Green qPCR Mix 2.0，正、反向引物各0.5 μl，2 μl cDNA模板，并用DEPC水补足至20 μl。使用PCR试剂盒进行扩增反应。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火、延伸30 s，扩增40个循环。以β-actin为内参，重复实验3次。计算PDGFD、PDGFR-β、E-cadherin、N-cadherin、Snail、Vimentin mRNA的表达。所需引物由生工生物工程科技（北京）股份有限公司合成纯化。引物序列见表1。

表1 引物序列

基因名称引物序列（5’→3’）引物大小（bp）Snail98正向引物CACCTCCAAACCCACTCG反向引物CCAGACTCTTGGTGCTTGTG PDGFD-β101正向引物AGTTGTTGCTGTCCGTGTT反向引物GGTGCTGGAGATGTTGAGA E-cadherin80正向引物TCAGTTCCGAGGTCTACAC反向引物CTTCAAATCTCACTCTGCCC N-cadherin60正向引物GGACACGAATGACATATAAAGG反向引物CCCTACACTAAACACCAAGAC Vimentin80正向引物CCCTTAAAGGCACTAACGAG反向引物GGTAGTTAGCAGCTTCAAGG PDGFD80正向引物GGAACTGTCAACTGGAAGTC反向引物AGGCTCAAACTTCAATACCTCβ-actin163正向引物GCTATGTTGCTCTAGACTTCG反向引物GGATTCCATACCCAAGAAGG

1.5 统计学方法

采用GraphPad Prism 9.5统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-qPCR法验证稳转株构建效率

过表达稳转株786-O细胞较空载组细胞有更高的基因表达水平，过表达倍数约为10.7倍（P＜0.05）。见图1。

图1 RT-qPCR验证稳转株构建效率（n=3）

2.2 三仙胶囊不同浓度含药血清对786-O细胞增殖的影响

浓度0%组比较，三仙胶囊含药血清各浓度组细胞活力均有不同程度的下降（P＜0.05），在24 h和48 h时间点，20%含药血清组活力最低，而且在24 h时对细胞的抑制率最高，选择20%作为最佳干预浓度，24 h作为Transwell实验、Western blot法、RT-qPCR最佳干预时间点。见图2。

图2 三仙胶囊不同浓度含药血清和时间对786-O细胞活力的影响（n=3）

2.3 各组细胞活力和克隆能力的比较

细胞培养48、72、96 h时，三仙胶囊组细胞活力低于空白对照组（P＜0.05）；细胞培养24、48、72、96 h时PDGFD过表达组细胞活力高于空白对照组（P＜0.05）；细胞培养48、72、96 h时，三仙胶囊+PDGFD过表达组细胞活力高于三仙胶囊组且低于PDGFD过表达组（P＜0.05）。见图3。细胞培养11 d时，三仙胶囊组细胞克隆数低于空白对照组；PDGFD过表达组细胞克隆数高于空白对照组；三仙胶囊+PDGFD过表达组细胞克隆数高于三仙胶囊组且低于PDGFD过表达组（P＜0.05）。见图4。

图3 各组细胞增殖能力比较（n=3）

图4 各组细胞克隆形成能力比较（n=3）

2.4 各组细胞划痕愈合能力的比较

细胞培养12、24 h时，三仙胶囊组细胞划痕愈合能力低于空白对照组（P＜0.05），PDGFD过表达组细胞划痕愈合能力高于空白对照组（P＜0.05），三仙胶囊+PDGFD过表达组细胞划痕愈合能力高于三仙胶囊组且低于PDGFD过表达组（P＜0.05）。见图5。

图5 各组细胞划痕愈合能力比较（n=3）

2.5 各组细胞迁移和侵袭能力的比较

三仙胶囊组迁移和侵袭的细胞数低于空白对照组，PDGFD过表达组迁移和侵袭的细胞数高于空白对照组，三仙胶囊+PDGFD过表达组迁移和侵袭的细胞数高于三仙胶囊组且低于PDGFD过表达组（P＜0.05）。见图6。

图6 各组细胞迁移和侵袭能力比较（n=3）

2.6 各组相关蛋白水平的比较

三仙胶囊组PDGFD、PDGFR-β、N-cadherin、Snail、Vimentin蛋白表达水平低于空白对照组，E-cadherin蛋白表达水平高于空白对照组；PDGFD过表达组PDGFD、PDGFR-β、N-cadherin、Snail、Vimentin蛋白表达水平高于空白对照组，E-cadherin蛋白表达水平低于空白对照组；三仙胶囊+PDGFD过表达组PDGFD、PDGFR-β、N-cadherin、Snail、Vimentin蛋白表达水平高于三仙胶囊组且低于PDGFD过表达组，E-cadherin蛋白表达水平低于三仙胶囊组且高于PDGFD过表达组（P＜0.05）。见图7、8。

图7 各组PDGFD、PDGFR-β、E-cadherin、N-cadherin、Snail、Vimentin蛋白条带

图8 各组PDGFD、PDGFR-β、E-cadherin、N-cadherin、Snail、Vimentin蛋白表达水平比较（n=3）

2.7 各组相关mRNA水平的比较

三仙胶囊组PDGFD、PDGFR-β、N-cadherin、Snail、Vimentin mRNA表达量低于空白对照组，E-cadherin mRNA表达量高于空白对照组；PDGFD过表达组PDGFD、PDGFR-β、N-cadherin、Snail、Vimentin mRNA表达量高于空白对照组，E-cadherin mRNA表达量低于空白对照组；三仙胶囊+PDGFD过表达组PDGFD、PDGFR-β、N-cadherin、Snail、Vimentin mRNA表达量高于三仙胶囊组且低于PDGFD过表达组，E-cadherin mRNA表达量低于三仙胶囊组且高于PDGFD过表达组（P＜0.05）。见图9。

图9 各组PDGFD、PDGFR-β、E-cadherin、N-cadherin、Snail、Vimentin mRNA表达量比较（n=3）

3 讨论

肾癌作为泌尿系统常见的恶性肿瘤，发病率逐年攀升，且因早期症状隐匿，多数患者确诊时已处于中晚期[21]。肾癌具有高度的异质性，不同病理类型和分期的肾癌在生物学行为、治疗反应及预后等方面均存在显著差异[22]。同时，肾癌的转移和复发是临床治疗的重点，其中EMT在肾癌的转移中发挥重要作用[23]。研究肾癌的增殖、迁移及EMT等生物学行为能够为阻断肿瘤转移、提高疗效提供新的思路。

中医药凭借多靶点、多途径、不易耐药等优势在肾癌治疗中占据重要地位。王晞星教授认为正气亏虚是肿瘤形成的基本病机，阴阳失调导致肾虚[6，24]。三仙胶囊组方为仙茅、淫羊藿、巴戟天、当归、知母、黄柏、白花蛇舌草、浙贝母、苦参、莪术、薏苡仁、仙鹤草、八月札，具有益肾扶正的功效，可以有效改善患者症状、延长生存期、防治复发转移。前期研究证实，三仙胶囊对肾癌细胞增殖有显著抑制作用，而且还有较强的诱导凋亡的作用，三仙胶囊下调缺氧诱导因子-1α、血管内皮生长因子表达和抑制肿瘤细胞增殖[8，25]。

研究表明EMT与肿瘤转移密切相关，近期发表在Nature杂志上的1篇文章展示了在鳞状细胞癌小鼠模型中，NP137介导的netrin-1降低了发生EMT的比例，减少了转移灶数量[26]。研究表明，EMT癌细胞衍生的外泌体miR-27b-3p通过增加结直肠癌血管通透性促进肿瘤细胞的转移[27]。卢毓康[28]的研究结果也显示肾癌细胞可以通过传递携带有丰富miR-155-5p的细胞外囊泡给周围正常上皮细胞，诱导EMT发生的同时促进上皮细胞发生一系列恶性变化。肾癌细胞发生EMT时，同样地表现为上皮细胞标志物E-cadherin下调，间质细胞标志物N-cadherin、Snail和Vimentin等上调，上皮表型细胞发生EMT并向远处转移，从而促进癌细胞迁移和侵袭[29]。本实验结果显示，三仙胶囊可以增加E-cadherin蛋白的表达，降低N-cadherin、Snail和Vimentin蛋白的表达，提示三仙胶囊可以通过抑制EMT来抑制肾癌细胞的迁移和侵袭。

PDGFD通过特异性结合并激活其同源受体PDGFR-β来发挥其细胞效应，PDGFR-β磷酸化后触发许多下游信号通路调控肿瘤的增殖、迁移和侵袭，PDGFD通过上调转化生长因子-β、基质金属蛋白酶、E-cadherin等的表达来增加癌细胞的侵袭、血管生成和转移[17，30]。PDGFD信号传导途径是治疗人类癌症的潜在治疗靶标。本研究通过对细胞进行过表达PDGFD来探索其在肾癌EMT机制中的作用，实验结果显示，过表达PDGFD后相关蛋白表达升高，而E-cadherin蛋白表达降低，过表达PDGFD能逆转三仙胶囊含药血清对肾癌EMT的抑制作用，从而也证明三仙胶囊可以通过PDGFD信号通路来抑制肾癌EMT。

综上所述，三仙胶囊含药血清可通过下调PDGFD表达，抑制肾癌786-O细胞中EMT进程——上调上皮标志物E-cadherin、下调间质标志物N-cadherin、Snail、Vimentin，进而有效抑制肾癌细胞的增殖、迁移与侵袭；而过表达PDGFD可逆转上述抑制效应，进一步明确PDGFD信号通路是三仙胶囊发挥抗肾癌转移作用的关键靶点。这一结果不仅为三仙胶囊防治肾癌转移的临床应用提供实验依据，也为从PDGFD/EMT轴探索肾癌治疗新策略提供了思路。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Study on the mechanism of Sanxian Capsules on renal cancer proliferation,migration, and epithelial-mesenchymal transformation based on PDGFD signaling pathway

TIAN Mengya1 JING Xufeng1 WANG Xinwen2

1.The First Clinical College, Shanxi University of Chinese Medicine, Shanxi Province, Jinzhong 030600, China;2.Department of Oncology, Shanxi Traditional Chinese Medicine Hospital, Shanxi Province, Taiyuan 030012, China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Sanxian Capsules in regulating the PDGFD signaling pathway on the proliferation, migration, and epithelial-mesenchymal transition (EMT) of renal cancer. Methods The 786-O cells were cultured. 786-O cells were treated with serum medium containing different concentrations of Sanxian Capsules.CCK8 assay was used to detect cell viability and screen the optimal intervention concentration and duration. A PDGFD-overexpressing 786-O cell model was established by lentiviral transfection, and transfection efficiency was verified via RT-qPCR. Cells were divided into four groups:blank control group, Sanxian Capsules group, Sanxian Capsules + PDGFD overexpression group, and PDGFD overexpression group. The CCK8 assay and the plate colony assay were used to detect the cell proliferation ability. The scratch assay and Transwell migration assay were used to detect the cell migration ability. Transwell invasion assay was used to detect the invasive ability of cells. The Western blot method and RT-qPCR were used to investigate the effects of the drug-containing serum of Sanxian Capsules on the protein expression levels and mRNA expression quantities of PDGFD, PDGFR-β, E-cadherin, N-cadherin, Snail, and Vimentin in renal cancer cells. Results Compared with the 0% concentration group, the cell viability in each concentration group of the Sanxian Capsules-containing serum was decreased to varying degrees (P＜0.05). The optimal intervention concentration and time were 20% and 24 hours,respectively. The cell viability at 48, 72 hours, and 96 hours, cell clone number at 11 days, cell scratch healing ability at 12 and 24 hours, migration and invasion cell numbers at 24 hours in the Sanxian Capsules group were lower than those in the blank control group (P＜0.05); the cell viability at 24, 48, 72 hours, and 96 hours, cell clone number at 11 days,cell scratch healing ability at 12 hours and 24 hours, migration and invasion cell numbers at 24 hours in the PDGFD overexpression group were higher than those in the blank control group (P＜0.05); the cell viability at 48, 72 hours, and 96 hours, cell clone number at 11 days, cell scratch healing ability at 12 hours and 24 hours, migration and invasion cell numbers at 24 hours in the Sanxian Capsules + PDGFD overexpression group were higher than those in the Sanxian Capsules group but lower than those in the PDGFD overexpression group (P＜0.05). In the Sanxian Capsules group the protein expression levels and mRNA expression quantities of PDGFD, PDGFR-β, N-cadherin, Snail, and Vimentin were lower than those in the blank control group, while the protein expression level and mRNA expression quantity of E-cadherin were higher than those in the blank control group (P＜0.05). In the PDGFD overexpression group, the protein expression levels and mRNA expression quantities of PDGFD, PDGFR-β, N-cadherin, Snail, and Vimentin were higher than those in the blank control group, while the protein expression level and mRNA expression quantity of E-cadherin were lower than those in the blank control group (P＜0.05). In the Sanxian Capsules + PDGFD overexpression group, the protein expression levels and mRNA expression quantities of PDGFD, PDGFR-β, N-cadherin, Snail, and Vimentin were higher than those in the Sanxian Capsules group but lower than those in the PDGFD overexpression group, while the protein expression level and mRNA expression quantity of E-cadherin were lower than those in the Sanxian Capsules group but higher than those in the PDGFD overexpression group (P＜0.05). Conclusion The Sanxian Capsules-containing serum can inhibit renal cancer, while overexpression of PDGFD can specifically reverse the inhibitory effect of Sanxian Capsules on renal cancer. Sanxian Capsules may down-regulate the expression of PDGFD to inhibit the EMT process of renal cancer, thereby inhibiting the proliferation, migration, and invasion of renal cancer.

[Key words] Traditional Chinese medicine; Sanxian Capsules; Renal cancer; PDGFD; Epithelial-mesenchymal transition

[中图分类号] R273

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）05（b）-0077-08

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25091143

[基金项目] 北京大地医疗慈善基金会项目（DDYL-A-KT-20250805-0014）。

[作者简介]

田梦雅（1999.5-），女，山西中医药大学第一临床学院2023级中医内科学专业在读硕士研究生，主要从事中医药防治肿瘤的研究工作。

[通讯作者] 汪欣文（1973.3-），女，硕士，主任医师，硕士生导师，主要从事中医药防治肿瘤的研究工作。

（收稿日期：2025-09-15）

（修回日期：2026-01-10）