宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率在全球范围内呈逐年上升趋势[1]。晚期宫颈癌一般采用放化疗，但长期治疗易发生耐药，导致患者生存率降低及预后不佳[2]。微RNA（microRNA，miRNA）是一种高度保守的内源性非编码RNA，其通过调控mRNA稳定性，在细胞分化及凋亡等过程中发挥重要调节作用[3]。miRNA通过促进靶mRNA降解或结合mRNA调控靶mRNA的稳定性，影响mRNA的翻译效率[4]。研究显示，miRNA能调控宫颈癌的发生、发展及化疗耐药的形成[5-7]。其中，宫颈癌组织中miR-145表达降低，其与人乳头状瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染进程及HPV感染引起的宫颈癌患者病情进展有关[8]。miR-145负向调控宫颈癌细胞侵袭和迁移能力的分子机制已部分阐明[9]；然而，其在宫颈癌紫杉醇耐药中的作用机制仍有待研究。

TLR4是炎症信号通路的关键蛋白，与配体结合后启动下游MyD88依赖或非依赖信号通路，从而促进细胞增殖、分化及多种炎症因子的释放[10]。慢性炎症与肿瘤的发生、发展密切相关，而介导炎症的TLR4与多种肿瘤的生物学行为密切相关[11-12]。研究显示，宫颈癌组织中TLR4高表达，且TLR4表达与肿瘤病变程度密切相关[13]。但TLR4信号通路在宫颈癌耐药形成中的具体作用机制尚未清晰，且miR-145是否通过调控TLR4信号通路参与炎症反应及化疗耐药的调节亦有待进一步研究。故本研究通过调控miR-145表达，探讨其对紫杉醇耐药宫颈癌细胞的生物活性，以及对TLR4/MyD88信号通路的调节作用，以期评估其在耐药性宫颈癌治疗中的潜在价值。

1 材料与方法

1.1 细胞

宫颈癌细胞系HeLa购自上海西格生物科技有限公司，经STR鉴定,确认无支原体污染后用于实验。紫杉醇（paclitaxel，PTX）耐药HeLa细胞株（HeLa/PTX）根据李倩等[14]的研究方法构建。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂 胎牛血清（货号：A5256701）、青-链霉素（货号：15140-148）、RPMI1640培养基（货号：61870036）、Opti-MEM培养基（货号：31985062）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；PTX（货号：HY-B0015）、miR-145模拟物对照（货号：HY-R04602）、miR-145模拟物（货号：HY-R00281）、miR-145抑制剂对照（货号：HY-RI04602）、miR-145抑制剂（货号：HY-RI00281）购自美国MCE公司。

MTT试剂盒（货号：C0009S）、RIPA裂解液（货号：P0013）、蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物（货号：P1045）购自上海碧云天生物科技有限公司；RNA提取试剂盒（货号：19211ES60）、RT-qPCR试剂盒（货号：11175ES70）、ECL显影液（货号：36222ES60）购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；TLR4抗体（货号：ab22048）购自美国Abcam公司；MyD88抗体（货号：23230-1-AP）、TNF-α抗体（货号：60291-1-AP）购自武汉三鹰生物技术有限公司；NF-κB p65抗体（货号：8242）、p-NF-κB p65抗体（货号：3031）、IL-1β抗体（货号：12242）购自美国CST公司；β-actin抗体（货号：30102ES40）、HRP-conjugated Goat-anti-rabbit IgG（H+L）（货号：33101ES60）、HRP-conjugated Goat-anti-mouse IgG（H+L）（货号：33201ES60）购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司。

1.2.2 主要仪器 化学发光显影仪（型号：Chemiscope 6000）购自上海勤翔科学仪器有限公司；分光光度计（型号：SP-UV2102）购自大龙兴创实验仪器（北京）股份公司；实时荧光定量PCR仪（型号：ABI 7500）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；酶标仪（型号：CMax plus）购自美谷分子仪器（上海）有限公司；离心机（型号：D3024）购自大龙兴创实验仪器（北京）股份公司。

1.3 细胞培养

将冻存的HeLa、HeLa/PTX细胞在37 ℃快速复苏。HeLa细胞培养于含有10%胎牛血清和1%青-链霉素的RPMI1640培养基中；HeLa/PTX细胞培养于上述培养基中并加入5 μmol/L的PTX以维持其耐药表型。细胞培养过程中每日观察生长状态，待生长稳定后进行传代，取稳定生长的第3代细胞用于实验。实验前将HeLa/PTX细胞撤除PTX培养48 h后用于后续实验。

1.4 细胞转染

HeLa/PTX细胞分为miR-145抑制剂对照组、miR-145抑制剂组、miR-145模拟物对照组和miR-145模拟物组。将HeLa/PTX细胞按5×104个/孔接种于6孔板中，待细胞融合度约70%时，使用Opti-MEM培养基进行转染。按照转染试剂说明书配制miR-145抑制剂、miR-145模拟物及其相应阴性对照的转染复合物，并分别加入各组细胞中。细胞于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育6 h后更换为完全培养基，继续培养72 h后收集细胞用于后续实验。

1.5 半数抑制浓度（IC50）检测

1.5.1 HeLa、HeLa/PTX细胞对PTX的IC50值 采用MTT法检测细胞对PTX的IC50值。将PTX用RPMI1640培养基进行梯度稀释，配制成不同浓度梯度备用。细胞经0.25%胰酶消化后收集，细胞按2× 103个/孔接种在96孔板中，每孔加入含不同浓度PTX的培养基，设置空白对照孔、细胞对照孔及药物处理孔，每个浓度设3个复孔，于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h。检测HeLa、HeLa/PTX细胞对PTX的IC50值。

1.5.2 转染后HeLa/PTX细胞对PTX的IC50值 药物处理后，每孔加入10 μl MTT溶液，继续孵育4 h，随后加入100 μl结晶溶解液，避光孵育3 h。使用酶标仪在570 nm波长处测定吸光度值，计算细胞存活率，并据此绘制剂量-反应曲线，计算IC50值。细胞存活率（%）=（A实验组-A空白孔）/（A对照组-A空白孔）×100%。

1.6 RT-qPCR法检测基因表达

药物处理3 d后弃培养基，PBS洗涤细胞，提取总RNA进行RT-qPCR检测。反应总体系为10 μl，包括2×Hifair® advanced SG buffer 5 μl，Hifair® advanced UH enzyme mix 0.5 μl，10 μmol/L的正、反向引物各0.2μl， 1 μl RNA样本（约100 ng），RNase-free ddH2O 3.1μl。反应条件为：95 ℃15 min；94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s，共40个循环，以GAPDH为内参，采用2–ΔΔCt法计算目的基因mRNA含量。引物序列见表1。

表1 引物序列

基因名称引物序列（5’→3’）miR-145-3p正向引物：GGGGATTCCTGGAAATA17反向引物：TGCGTGTCGTGGAGTC16引物长度（nt）TLR4正向引物：AGACCTGTCCCTGAACCCTAT21反向引物：CGATGGACTTCTAAACCAGCCA22 MyD88正向引物：GGCTGCTCTCAACATGCGA19反向引物：CTGTGTCCGCACGTTCAAGA20 GAPDH正向引物：CGCTTCGGCAGCACATATAC20反向引物：AAATATGGAACGCTTCACGA20

1.7 Western blot法检测相关蛋白表达

药物处理72 h后收集细胞，使用RIPA裂解液在冰上裂解细胞以提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。每个样本取30 μg蛋白经SDS-PAGE分离后转移至PVDF膜，3%脱脂奶粉封闭1 h。加入相应一抗（抗TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β及β-actin抗体，稀释比均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后加入HRP标记的二抗（稀释比1∶2 000）孵育 1 h。采用ECL化学发光法显影并进行蛋白表达分析。

1.8 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（）表示，比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HeLa、HeLa/PTX细胞对PTX的IC50值

与HeLa细胞比较，HeLa/PTX细胞在较高浓度PTX处理下仍保持较高的细胞活力，HeLa细胞对PTX的IC50值为7.6 μmol/L，而HeLa/PTX细胞对PTX的IC50值为18.2 μmol/L。见图1。

图1 HeLa、HeLa/PTX细胞对PTX的IC50值（n=3）

2.2 转染后HeLa/PTX细胞对PTX的IC50值

与miR-145抑制剂对照组比较，miR-145抑制剂组HeLa/PTX细胞对PTX的IC50值由17.6 μmol/L升至35.0 μmol/L；与miR-145模拟物对照组比较，miR-145模拟物组HeLa/PTX细胞对PTX的IC50值由19.0 μmol/L降至9.5 μmol/L。见图2。

图2 各组转染后HeLa/PTX细胞对PTX的IC50值（n=3）

2.3 miR-145对TLR4和MyD88转录表达的调控作用

miRNA靶点预测工具TargetScan分析结果显示，TLR4、MyD88可能是miR-145结合调控的靶mRNA；TargetScan对miRNA的结合位点预测结果显示，miR-145可能结合在TLR4与MyD88 mRNA的3’UTR区域。

与miR-145抑制剂对照组比较，miR-145抑制剂组TLR4和MyD88 mRNA表达升高（P＜0.01）；与模拟物对照组比较，miR-145模拟物组TLR4、MyD88 mRNA表达降低（P＜0.05或P＜0.01）。见图3。

图3 各组转染后TLR4、MyD88 mRNA表达比较（n=3）

2.4 miR-145对TLR4/MyD88及下游信号通路蛋白表达的影响

与miR-145抑制剂对照组比较，miR-145抑制剂组TLR4、MyD88、p-NF-кB p65/NF-кB p65、TNF-α、IL-1β蛋白表达升高（P＜0.01）；与miR-145模拟物对照组比较，miR-145模拟物组TLR4、MyD88、p-NF-кB p65/NF-кB p65、TNF-α、IL-1β蛋白表达降低（P＜0.05或P＜0.01）。见图4。

图4 各组转染后TLR4/MyD88及下游信号通路蛋白表达比较

3 讨论

PTX是从红豆杉中提取出的化合物，对宫颈癌的治疗效果较好，但肿瘤细胞在长期PTX治疗过程中易产生耐药性，影响治疗效果与患者预后，亟须开发新的药物治疗策略或新的药物以延缓PTX耐药形成[15]。

miRNA在癌症治疗及干预耐药过程中具有应用潜力，其通过调控靶基因mRNA稳定性而影响肿瘤细胞活动。miR-145位于5号染色体，其所在位点附近存在脆性位点，这些脆性位点与染色体的断裂、丢失有关[16]。miR-145在多种肿瘤中低表达，miR-145过表达可抑制癌细胞增殖和侵袭能力，其可调控肿瘤的发生、发展及血管生成[17-19]。miR-145通过多种分子机制调控肿瘤耐药，通过下调Bcl-2和P-糖蛋白水平使乳腺癌耐药细胞株的存活率降低，同时削弱耐药性[20]；提高miR-145表达可抑制胃癌细胞的增殖能力并促进细胞凋亡，从而提高耐药细胞株对顺铂的敏感性[21]。然而，目前miR-145在PTX耐药形成过程中的作用机制鲜见报道。

TLR4调控炎症及信号转导，影响细胞活性，TLR4转导的免疫反应是炎症反应的起点[22]。TLR4介导的炎症反应是许多重大疾病的重要通路，宫颈癌的发展史起于宫颈炎，TLR4通过识别HPV并将其清除，持续诱发炎症反应促进宫颈上皮增生，最终导致肿瘤形成[23-24]。王娟等[25]研究表明，宫颈癌细胞TLR4高表达；抑制TLR4表达可通过降低宫颈癌细胞的炎症反应而提高免疫功能。MyD88是TLR4信号通路下游关键的转导蛋白，MyD88与TLRs的TIR结构域与死亡域（DD）结合激活下游分子，可转导除TLR3以外的TLRs信号，介导炎症信号转导[26]。邹冬玲等[27]研究显示，卵巢癌PTX耐药细胞MyD88高表达，下调MyD88表达可削弱卵巢癌耐药细胞对PTX的耐药性。由此可见，miR-145在癌症治疗的应用中具有较大潜力，但其作用机制并未完全阐明。为探究miR-145对耐药的调控作用，本研究对PTX耐药宫颈癌细胞株进行研究，并从分子表达水平和细胞活力变化层面探究miR-145对宫颈癌PTX耐药细胞株的影响。

本研究结果显示，HeLa/PTX细胞转染后，TLR4、MyD88 mRNA和蛋白表达降低，下游NF-κB信号通路转导受到抑制，导致炎症因子TNF-α、IL-1β水平降低，而miRNA抑制剂的使用则表现出相反的效果。本研究提示miR-145对PTX耐药有逆转效果，为使用miR-145这一靶点预测PTX治疗宫颈癌患者的耐药性及预后分析提供研究基础。

本研究存在一定的局限性：本研究基于细胞实验，未在动物或临床样本层面进一步阐明miR-145的表达特征及作用机制，未来需深入研究以揭示miR-145在宫颈癌患者中的临床应用价值。

综上所述，本研究结果显示，miR-145增加HeLa/PTX细胞的药物敏感性，其可能通过负向调控TLR4、MyD88的表达，进而抑制PTX耐药株的炎症反应。这些结果为研究miR-145在PTX耐药宫颈癌细胞中的作用机制提供参考，提示miR-145通过靶向炎症信号通路的关键调控因子发挥抗炎作用。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Study on the molecular mechanism of miR-145 regulating the TLR4/MYD88 signaling pathway to improve Paclitaxel resistance in cervical cancer

HAN Chaohui WANG Ri WU Qingyan HAN Yueming▲

Clinical Laboratory, the Third People’s Hospital of Haikou City, Hainan Province, Haikou 570100, China

[Abstract] Objective To investigate the mechanism by which miR-145 affects Paclitaxel (PTX) resistance in cervical cancer by regulating the TLR4/MyD88 signaling pathway. Methods HeLa cells and their PTX-resistant strains (HeLa/PTX) were cultured in vitro, and the median inhibitory concentration (IC50) of PTX to the cells was detected by the MTT method. HeLa/PTX cells were divided into miR-145 inhibitor control group, miR-145 inhibitor group, miR-145 mimic control group, and miR-145 mimic group. After transfection, the cell proliferation activity was detected and the IC50 value of HeLa/PTX cells to PTX was calculated. The gene expressions of TLR4 and MyD88 were detected by RT-qPCR;the expressions of TLR4/MyD88 and downstream signaling pathway protein were detected by Western blot. Results The IC50 value of HeLa/PTX cells to PTX was higher than that of HeLa cells; and the IC50 value of PTX by HeLa/PTX cells in the miR-145 inhibitor group was higher than that in the miR-145 inhibitor control group; while the IC50 value of PTX in the miR-145 mimic group of HeLa/PTX cells was lower than that in the miR-145 mimic control group. Compared with the miR-145 inhibitor control group, the expressions of TLR4 and MyD88 mRNA in the miR-145 inhibitor group and the expressions of TLR4, MyD88, p-NF-кB p65/NF-кB p65, TNF-α, and IL-1β protein in the miR-145 inhibitor group increased (P＜0.01); compared with the miR-145 mimic control group, the expressions of TLR4 and MyD88 mRNA and the expressions of TLR4, MyD88, p-NF-кB p65/NF-кB p65, TNF-α, and IL-1β protein in the miR-145 mimic group were decreased (P＜0.05 or P＜0.01). Conclusion miR-145 may suppress the inflammatory responses of HeLa/PTX cells and enhance the sensitivity of HeLa/PTX cells to PTX by down-regulating the expression of TLR4 and MyD88 and inhibiting the transduction of the NF-κB signaling pathway.

[Key words] miR-145; Cervical cancer; Paclitaxel;Resistant; TLR4; MyD88

[中图分类号] R737

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）05（c）-0029-06

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25100631

[基金项目] 海南省卫生计生行业科研项目（20A200138）。

▲通讯作者

（收稿日期：2025-10-13）

（修回日期：2026-01-15）