非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种以肝内脂质异常沉积为特征的慢性代谢性肝病，与肥胖和代谢综合征密切相关，发病率不断上升，已成为全球公共健康问题[1-2]。其病程涉及脂质代谢紊乱、炎症反应和氧化应激等多环节，目前缺乏经临床验证的特异性治疗药物，开发新型干预策略尤为迫切[3-4]。去甲汉黄芩素为中药来源的黄酮类化合物，具抗炎和抗氧化等活性[5]。但其在NAFLD中的作用尚未明确。AKR1B10在肝病中高表达，可促进脂质合成并加重炎症与氧化应激，被认为是NAFLD进展的重要调控分子[6-7]。同时，AMPK作为能量代谢关键酶，在脂质代谢调控与抗氧化应激中具有核心作用[8]。

本研究通过网络药理学、分子对接及细胞实验，探讨去甲汉黄芩素改善NAFLD的潜在机制，重点评估其是否通过靶向AKR1B10并调控AMPK信号通路，从而为其应用于NAFLD防治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 去甲汉黄芩素作用靶点预测

通过中药系统药理学数据库（https：// www. tcmsp-e.com/load_ intro. php?id=43）、SwissTargetPrediction（https：//swisstar getprediction.ch/）、PHARMAPP（http：//lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/）和比较毒理基因组学数据库（https：//ctdbase.org）筛选去甲汉黄芩素的潜在作用靶点。

1.2 NAFLD相关基因筛选

从GEO数据库（https：//www. ncbi.nlm.nih. gov/geo/）获取NAFLD转录组数据集GSE89632，利用R语言limma包筛选差异表达基因，筛选条件为|log2FC|＞0.58且P＜0.05[9]。

1.3 基因本体（gene ontology，GO）与京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析

为探讨去甲汉黄芩素作用靶点在NAFLD发生和发展中的潜在生物学功能，对预测靶点与NAFLD差异表达基因的交集进行功能富集分析。采用R语言中的clusterProfiler包进行GO与KEGG富集分析。

1.4 加权基因共表达网络分析（weighted gene coexpression network analysis，WGCNA）

对GSE89632数据集进行WGCNA分析，构建基因共表达网络，识别与NAFLD表型高度相关的模块基因。选择与疾病特征相关性最高的模块作为候选核心模块，为后续靶点筛选提供参考。

1.5 随机森林算法筛选核心靶点

将WGCNA高相关模块基因、差异表达基因与去甲汉黄芩素预测靶点的交集基因通过随机森林模型（R语言randomForest包）进行特征重要性排序。选取排名前3位的基因作为去甲汉黄芩素治疗NAFLD的核心靶点，为后续分子对接及细胞实验提供靶标依据。

1.6 分子对接

利用AutoDock Vina软件对去甲汉黄芩素与核心靶点蛋白进行分子对接分析。蛋白受体结构从PDB数据库（https://www.rcsb.org/）下载，去除水分子和配体后进行氢化与能量最小化处理；去甲汉黄芩素的小分子结构经Chem3D优化后导入进行对接。

1.7 主要试剂与仪器

人肝癌细胞株HepG2（货号：KC0101，广州科珞捷生物技术有限公司）；去甲汉黄芩素[货号：M44470，奥默生物技术（上海）有限公司]；CCK8试剂盒（货号：CK04，日本同仁化学公司）；胎牛血清（货号：C04001，上海逍鹏生物科技有限公司）；青霉素-链霉素溶液（货号：C3420，上海逍鹏生物科技有限公司）；TRIzol试剂（货号：R401-01，南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；PrimeScript RT反转录试剂盒（货号：RR036A，日本TaKaRa公司）；TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（货号：RR820A，日本TaKaRa公司）；RIPA裂解液（货号：P0013B，上海碧云天生物技术股份有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒（货号：P0012，上海碧云天生物技术股份有限公司）；AKR1B10、AMPK、β-actin一抗（货号：18252-1-AP、10929-2-AP、66009-1-Ig，武汉三鹰生物技术有限公司）；p-AMPK一抗（货号：ab133448，英国abcam公司）；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（货号：BYHS500169、BYGR500038、BYHS500536，南京博研生物技术有限公司）；实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems 7500，美国Applied Biosystems公司）、微量分光光度计（NanoDrop 2000，美国Thermo Fisher Scientific公司）、凝胶成像系统（AI600 images，美国GE公司）、全自动生化分析仪（BS-800M，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）。

1.8 CCK8实验检测细胞活力

HepG2细胞接种于6孔板中，培养至对数生长期后均匀分配至96孔板并孵育过夜，使细胞贴壁稳定。去甲汉黄芩素以DMSO配制母液并以培养基稀释至所需浓度。随后将细胞分为不同处理组：对照组（加入等体积DMSO），以及5、10、20、40、80、160 μmol/L去甲汉黄芩素，作用48 h[5]。处理结束后，每孔加入10 μl CCK8试剂，在37 ℃、5%CO2条件下孵育2 h。随后使用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值，计算各浓度下细胞存活率。每组实验设置3个平行孔，并独立重复3次。

1.9 细胞培养与细胞处理

HepG2细胞在含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基中，于37 ℃、5%CO2条件下培养。细胞生长至对数期后分组处理：对照组仅加入等体积DMSO（终浓度＜0.1%）；模型组加入1 mmol/L游离脂肪酸（棕榈酸∶油酸=1∶2）诱导24 h以建立脂质积累模型[10]；去甲汉黄芩素组在1 mmol/L游离脂肪酸刺激24 h后，更换含40 μmol/L去甲汉黄芩素的培养基继续孵育48 h。处理结束后收集细胞及培养上清液用于后续RT-qPCR、Western blot法和ELISA检测。

1.10 甘油三酯（triglycerides，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、天冬氨酸转氨酶（aspartate transferase，AST）、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）的测定

采用全自动生化分析仪检测TG、TC、AST、ALT水平。

1.11 RT-qPCR法检测各基因mRNA表达量

提取细胞总RNA，使用核酸检测仪测定RNA的浓度和纯度，并用无酶水进行稀释，使其浓度约为300 ng/μl。取RNA样品10 μl反转录合成cDNA，反应体系包括：RNA 10 μl、5×Mix 4 μl、无酶水补足至20 μl，反转录反应条件如下：37℃ 15 min、85 ℃ 5 s，反应结束后将cDNA于-80 ℃保存备用。

RT-qPCR采用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）体系进行，反应总体积20 μl，包括：cDNA 2 μl、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10 μl、正向引物1 μl、反向引物1 μl、无RNA酶水6 μl。PCR扩增条件如下：95 ℃预变性30 s（1个循环）；95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，共40个循环。反应结束后进行溶解曲线分析以确认扩增特异性。检测基因为AKR1B10、AMPK、TNF-α、IL-6、IL-1β，β-actin作为内参基因，相对表达量采用2-ΔΔCt方法计算，引物序列如表1所示。

表1 引物序列

引物名称引物序列（5’→3’）引物长度（bp）AKR1B1043正向引物TCAGTACCAAAGCCAAGATGCC反向引物AGTCAATGTGCCGATATCCTG AMPK44正向引物TTGAAACCTGAAAATGTCCTGCT反向引物GGTGAGCCACAACTTGTTCTT TNF-α43正向引物TCGAACCCCGAGTGACAAGCC反向引物TTATCTCTCAGCTCCACGCCAT IL-646正向引物ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG反向引物CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG IL-1β40正向引物AGAATGACCTGAGCACCTT反向引物CACATAAGCCTCGTTATCCCAβ-actin41正向引物CATGTACGTTGCTATCCAGGC反向引物CTCCTTAATGTCACGCACGA

注 TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL：白细胞介素。

1.12 ELISA法检测炎症因子水平

为进一步验证去甲汉黄芩素对炎症反应的影响，采用ELISA法检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β的蛋白水平。细胞经不同处理后收集培养上清液，按照试剂盒说明书操作。具体步骤如下：将标准品和样品分别加入包被抗体的96孔板中孵育，洗板后依次加入生物素化抗体、酶结合物及底物显色液，反应结束后加入终止液终止反应，在450 nm波长下测定吸光值。根据标准曲线计算各样品中炎症因子的浓度。

1.13 Western blot法检测蛋白浓度

采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，并使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。经SDS-PAGE电泳分离后转移至PVDF膜。室温封闭1 h后，分别加入一抗（AKR1B10 1∶2 000，p-AMPK 1∶1 000，AMPK 1∶25 000，β-actin 1∶60 000）于4 ℃孵育过夜。经TBST洗涤后，加入相应的HRP标记二抗（1∶5 000）孵育1 h。显影采用化学发光检测系统完成，使用ImageJ软件测定各条带灰度值并扣除背景，计算相对灰度值：对于AKR1B10和AMPK，以β-actin作为内参，相对灰度值=目标蛋白灰度值/β-actin灰度值，对于p-AMPK，以AMPK作为内参，相对灰度值=p-AMPK灰度值/AMPK灰度值。进一步将对照组的相对灰度值设为1，其余各组结果以对照组为基准进行归一化，作为最终相对蛋白表达量。

1.14 数据分析

采用GraphPad Prism 8.0统计学软件对所得数据进行分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。所有细胞实验均独立重复3次，每组设3个复孔。生物信息学相关分析在R 4.2.1软件下完成，主要使用limma、clusterProfiler、randomForest、WGCNA等R包。分子对接采用AutoDock Vina 1.2.0软件完成，可视化分析使用Py-MOL 2.5.0软件。

2 结果

2.1 去甲汉黄芩素潜在作用靶点及NAFLD差异基因筛选

通过中药系统药理学数据库、SwissTargetPrediction、PharmMapper和比较毒理基因组学数据库预测并整合去甲汉黄芩素潜在作用靶点，共获得169个候选基因（图1A）。从GEO数据库GSE89632数据集中筛选出2 131个差异表达基因，将其与去甲汉黄芩素潜在作用靶点取交集，得到25个重叠基因（图1B、C）。

图1 去甲汉黄芩素靶点预测、差异基因分析

2.2 功能富集分析及核心靶点确定

GO富集分析显示，候选靶点主要涉及细胞增殖调控等生物学过程；KEGG富集分析提示候选靶点与AMPK信号通路相关（图2A、B）。WGCNA分析显示，深灰模块与NAFLD的相关性最高，相关系数为0.8（图2C）。将WGCNA深灰模块基因、差异表达基因及去甲汉黄芩素预测靶点取交集，共获得7个候选基因（图3A）。随机森林特征重要性分析显示，CEBPA、AKR1B10和ADH5重要性排名前3位（图3B）。分子对接结果显示，去甲汉黄芩素可与ADH5、AKR1B10和CEBPA稳定结合，其中与AKR1B10的结合亲和力最强，结合能为-9.3 kcal/mol；与ADH5和CEBPA的结合能分别为-7.9 kcal/mol和-5.2 kcal/mol（图3C），提示AKR1B10可能为去甲汉黄芩素治疗NAFLD的关键作用靶点。

图2 差异基因富集分析以及共表达网络分析

图3 核心基因筛选与分子对接

2.3 去甲汉黄芩素对HepG2细胞活力的影响

5～40 μmol/L去甲汉黄芩素浓度组细胞活力与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），而80和160 μmol/L去甲汉黄芩素浓度组细胞活力下降（P＜0.05）（图4A）。因此，40 μmol/L为去甲汉黄芩素不影响细胞活力的最大安全给药浓度，后续实验均选取40 μmol/L进行处理。

图4 去甲汉黄芩素对HepG2细胞活力、脂质累积及炎症因子的影响

2.4 去甲汉黄芩素对脂质累积及肝损伤相关指标的影响

与对照组比较，模型组TG、TC、AST、ALT水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，去甲汉黄芩素组TG、TC、AST、ALT水平降低（P＜0.05）。见图4B～E。

2.5 去甲汉黄芩素对炎症因子表达的影响

与对照组比较，模型组TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表达量及培养上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，去甲汉黄芩素组TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表达量及培养上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平降低（P＜0.05）。见图4F～K。

2.6 去甲汉黄芩素对AKR1B10及AMPK通路相关表达的影响

与对照组比较，模型组AKR1B10 mRNA表达量和蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，去甲汉黄芩素组AKR1B10 mRNA表达量和蛋白表达水平降低（P＜0.05）。各组间AMPK mRNA表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组比较，模型组p-AMPK/AMPK比值降低（P＜0.05）；与模型组比较，去甲汉黄芩素组p-AMPK/AMPK比值升高（P＜0.05）。见图5。

图5 去甲汉黄芩素对AKR1B10、AMPK相关基因与蛋白表达的影响

3 讨论

本研究通过网络药理学及体外实验相结合的方法，揭示了去甲汉黄芩素可能通过靶向抑制AKR1B10并调控AMPK信号通路，从而改善FFA诱导的肝细胞脂质代谢紊乱和炎症反应。这一结果为进一步理解去甲汉黄芩素在NAFLD中的作用机制提供新的分子依据。

AKR1B10是醛酮还原酶家族的重要成员，参与脂肪酸代谢及细胞氧化还原稳态调控。已有研究发现，AKR1B10在肝脂肪变性和非酒精性脂肪性肝患者中显著上调[11]。AMPK通路在NAFLD治疗中的作用被广泛证实。已有报道显示，黄芩素及其衍生物通过激活AMPK通路抑制脂质合成相关基因并促进脂肪酸氧化[12]。

虽然目前关于AKR1B10与AMPK信号之间的直接关系研究较为有限，但基于本研究的实验结果及已知AKR1B10在脂质合成、氧化还原稳态中的功能，可以推测AKR1B10的抑制可能通过改善能量代谢压力和氧化应激状态进而激活AMPK通路。去甲汉黄芩素下调AKR1B10可减少脂质生成与脂滴堆积，从而改善线粒体脂代谢，促进AMPK激活。AMPK的激活进一步抑制脂质合成、促进脂肪酸氧化并抑制炎症反应，形成“AKR1B10-AMPK轴”的调控网络。这一推断为理解去甲汉黄芩素的多维度作用提供重要理论基础，也为深入解析NAFLD发生和发展过程中的新型代谢调控通路提供了潜在研究方向。

综上所述，去甲汉黄芩素可能通过抑制AKR1B10表达并促进AMPK磷酸化激活，从而改善脂质代谢、降低炎症反应并维持肝细胞稳态。该研究为阐明天然化合物在NAFLD干预中的分子机制提供新视角，也为开发以AKR1B10-AMPK轴为靶点的潜在治疗策略奠定基础。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Study on the mechanism of norwogonin targeting AKR1B10 to relieve nonalcoholic fatty liver disease

LIU Jingmei1 ZHAO Yajuan2 HAN Mengsi3 JIA Wenwen3

1.Department of Endocrinology Laboratory, Baoding NO.1 Central Hospital, Hebei Province, Baoding 071000, China;2.the First Department of Gastroenterology, Baoding NO.1 Central Hospital, Hebei Province, Baoding 071000, China;3.Department of Clinical Laboratory, Baoding NO.1 Central Hospital, Hebei Province, Baoding 071000, China

[Abstract] Objective To investigate whether norwogonin alleviates non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) by targeting AKR1B10, based on network pharmacology and in vitro cell experiments. Methods Potential targets of norwogonin were predicted using the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database, SwissTargetPrediction, Pharm-Mapper, and the Comparative Toxicogenomics Database. The GSE89632 dataset of liver tissues from NAFLD patients and healthy controls was downloaded from the GEO database. Differentially expressed genes were identified and intersected with drug targets to obtain candidate targets. Gene ontology functional enrichment and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway enrichment analyses were performed for the candidate targets. Core targets were further screened by weighted gene co-expression network analysis (WGCNA) and a random forest algorithm, followed by molecular docking validation. For in vitro experiments, a lipid accumulation model was established in HepG2 cells induced by free fatty acids (palmitic acid∶oleic acid = 1∶2). CCK8 assay was used to determine a safe concentration of norwogonin. Cells were divided into a control group (vehicle control), a model group (free fatty acid induction), and a norwogonin group (treated with 40 μmol/L norwogonin for 48 h after free fatty acid induction). Triglyceride (TG), total cholesterol(TC), aspartate aminotransferase (AST), and alanine aminotransferase (ALT) levels were measured using biochemical kits. Tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin (IL)-6, and IL-1β levels in the culture supernatant were determined by enzyme-linked immunosorbent assay. Protein expression of AKR1B10 and p-AMPK/AMPK was detected by Western blot. Results A total of 169 potential targets of norwogonin were identified. In the GSE89632 dataset, 2 131 differentially expressed genes were screened, and intersection analysis yielded 25 candidate targets. Enrichment analyses indicated that these candidate targets were closely associated with lipid metabolism and AMPK-related pathways. WGCNA and random forest analysis identified CEBPA, AKR1B10, and ADH5 as core targets, and molecular docking showed the strongest binding affinity between norwogonin and AKR1B10. The CCK8 assay demonstrated that 40 μmol/L norwogonin had no significant effect on HepG2 cell viability. Compared with the control group, the levels of TG, TC, AST, and ALT in the model group were increased (P＜0.05); compared with the model group, the levels of TG, TC, AST, and ALT in the norwogonin group were decreased (P＜0.05). Compared with the control group, the mRNA expression levels of TNF-α,IL-6, and IL-1β in the model group, as well as the levels of TNF-α, IL-6, and IL-1β in the culture supernatant, were all increased (P＜0.05); compared with the model group, the mRNA expression levels of TNF-α, IL-6, and IL-1β in the norwogonin group, as well as the levels of TNF-α, IL-6, and IL-1β in the culture supernatant, were all decreased (P＜0.05). Compared with the control group, the expression levels of AKR1B10 mRNA and protein in the model group were increased (P＜0.05); compared with the model group, the expression levels of AKR1B10 mRNA and protein in the norwogonin group were decreased (P＜0.05). Compared with the control group, the ratio of p-AMPK/AMPK in the model group were decreased (P＜0.05); compared with the model group, the ratio of p-AMPK/AMPK in the norwogonin group were increased (P＜0.05). Conclusion Norwogonin may exert potential protective effects on NAFLD by inhibiting the expression of AKR1B10 and promoting the phosphorylation and activation of AMPK, thereby improving lipid metabolism disorders and inflammatory responses.

[Key words] Norwogonin; Non-alcoholic fatty liver disease; AKR1B10; AMPK

[中图分类号] R285

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）05（c）-0062-09

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25092000

[基金项目] 河北省保定市科技计划基金资助项目（2541 ZF076）。

（收稿日期：2025-09-25）

（修回日期：2026-01-23）