心力衰竭是一种高发病率、高死亡率的疾病，已成为日益严峻的公共卫生问题[1]。心力衰竭核心病理特征之一是心肌纤维化，该过程通过引发心肌重塑，直接推动病情进程[2]。因此，延缓或逆转心肌纤维化被视为降低心力衰竭病死率的关键策略[3]。

近年来，趋化素作为一种新发现的脂肪因子备受关注，其与炎症、代谢综合征及心血管疾病的密切关系已被证实[4]。研究表明，在扩张型心肌病大鼠模型中，趋化素积极参与心脏的炎症反应、肥大及纤维化过程[5]。这一发现与临床观察相呼应，在心力衰竭风险更高的2型糖尿病患者中，同样检测到血清趋化素水平的升高[6]。在细胞层面，心肌成纤维细胞作为心脏数量最丰富的间质细胞，是心肌纤维化的主要执行者[7]。趋化素及其特异性受体——CMKLR1均在大鼠心肌成纤维细胞中表达，且其表达可被醛固酮上调，提示醛固酮可能是连接趋化素与纤维化的重要桥梁[8-9]。醛固酮已被证实是心肌纤维化的重要促进因子，其主要通过激活AT1/StAR/AS信号通路发挥作用，并能直接刺激心肌成纤维细胞的增殖与胶原蛋白沉积[10-12]。在心力衰竭模型中，活性氧水平升高会激活PI3K/Akt和NF-κB信号通路，进而促进炎性细胞因子的分泌，这些细胞因子对心肌细胞具有高度毒性[13]。基于上述研究背景，本研究旨在深入探讨趋化素/CMKLR1轴是否通过调控PI3K/Akt/NF-κB信号通路，在心肌纤维化的发生机制中发挥作用。研究成果有望为预防和逆转心肌纤维化提供新的理论依据和潜在治疗靶点。

1 对象与方法

1.1 实验动物

2~3日龄SPF级雄性SD大鼠100只，体质量10~15 g，由河北医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（冀）2022-001，实验动物使用许可证号：SCXK（冀）2021-002，实验动物合格证号：2303059。实验动物饲养于河北医科大学实验动物中心，温度20~25 ℃，湿度45%~60%，自由摄食饮水，昼夜明暗交替12 h/12 h，室内通风良好。

1.2 主要试剂与仪器

趋化素（上海吉玛制药技术有限公司，货号：A10001）；醛固酮（北京索莱宝科技有限公司，货号：A6910-1 mg）；PDTC（美国MCE公司，货号：HY-18738）；LY294002（美国MCE公司，货号：HY-10108）；青链霉素混合液（北京索莱宝科技有限公司，货号：P1400）；DMEM低糖培养液（美国GIBCO公司，货号：C11885500BT）；胎牛血清（北京索莱宝科技有限公司，货号：YZ-80230-6412）；胰蛋白酶-EDTA（北京索莱宝科技有限公司，货号：T1300）；DAPI染色液（武汉博士德生物工程有限公司，货号：AR1176）；波形蛋白抗体（美国OriGene公司，货号：OTI1A9）；FITC标记山羊lgG（美国OriGene公司，货号：AB0142）；RNA提取试剂盒（北京全式金生物技术有限公司，货号：ER501）；cDNA合成试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：R323）；PCR扩增试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：Q711）；EdU-488细胞增殖检测试剂盒（上海雅酶生物医药科技有限公司，货号：CX002）；p-PI3K（爱必信生物科技有限公司，货号：130868）；趋化素抗体（美国Santa Cruz Biotechnology公司，货号：sc-373797）；β-actin抗体（上海埃必威生物技术有限公司，货号：AB0035）；Akt抗体（货号：4685）、p-Akt抗体（货号：4060）、PI3K抗体（货号：4257）、NF-κB抗体（货号：8242）、p-NF-κB抗体（货号：3033）均购自美国CST公司；PCNA抗体（货号：AF0239）、CMKLR1抗体（货号：AF5291）均购自美国Affinity Biosciences公司。

二氧化碳细胞培养箱（型号：MCO175型，日本SANYO公司）；倒置显微镜（型号：ECLIPSE Ts2，日本Nikon公司）；-80 ℃冰箱（型号：MDR-382E型，日本SANYO公司）；恒温振荡器（型号：THZ-C，太仓市试验设备厂）；基因扩增仪（型号：A45279CN，美国Santa Cruz公司）；荧光定量PCR仪（型号：CFX96，美国Santa CruzBiotechnology公司）；酶标仪（型号：Muliskan MK3，上海雷勃分析仪器有限公司）；电泳仪（型号：DYCZ-24DN，北京六一仪器厂）。

1.3 心肌成纤维细胞的分离培养

心脏成纤维细胞取自新生SD大鼠的心脏组织。取心脏尖端组织，清洗2次后，注入消化酶混合液（含0.05%胰蛋白酶-EDTA和Ⅱ型胶原酶），并于37 ℃培养箱中孵育5 min。此消化过程重复6~8次，以充分解离组织，获得单个心肌成纤维细胞。将收集的细胞悬液通过75 µmol/L细胞滤器过滤，离心收集细胞沉淀。细胞接种于培养皿中，在培养箱中培养2 h，利用心肌成纤维细胞贴壁迅速的特性，差速贴壁法可使其优先附着。取成纤维细胞直至其增殖融合密度约98%时，使用0.05%胰蛋白酶-EDTA进行消化传代。本研究均采用第2代或第3代细胞进行实验。

1.4 心肌成纤维细胞增殖模型构建

为验证醛固酮对心肌成纤维细胞的促增殖作用，参照文献[10]建立醛固酮诱导的细胞增殖模型。将生长状态良好的细胞以5×105个/孔的密度接种于6 cm培养皿中，将其分为对照组和醛固酮组，置于细胞培养箱中干预。24 h后，EdU实验评估细胞DNA复制活性；RT-qPCR与Western blot法检测评估细胞增殖状态。实验重复3次。

1.5 实验分组与处理

①外源性趋化素对心肌成纤维细胞的影响：将细胞分为不同浓度外源性趋化素组（0、50、100、150、200 ng/ml），处理心肌成纤维细胞24 h，选取最优浓度进行后续实验。②通路抑制剂对心肌成纤维细胞的影响：将细胞分为对照组、趋化素组、PI3K/Akt通路抑制剂（LY294002）组（10 µmol/L）、NF-κB通路抑制剂（PDTC）组（1×10-8 mol/L）、趋化素（100 ng/ml）+LY294004组（10 µmol/L）、趋化素（100 ng/ml）+PDTC（1×10-8 mol/L）组。调整细胞密度至5×105个/孔，分别加入不同药物后培养24 h观察（抑制剂组中加入通路抑制剂处理2 h后换成普通培养基培养、趋化素+抑制剂组中先加入通路抑制剂处理2 h，再加入相应趋化素浓度的培养基培养）。

1.6 心肌成纤维细胞的鉴定

采用免疫荧光染色法鉴定心肌成纤维细胞标志物波形蛋白。将心肌成纤维细胞消化、离心重悬后，调整细胞密度至5×105个/孔，并接种于6孔板中，于37 ℃培养箱内培养至汇合度约80%，弃去培养基，洗涤3次。固定、透化及封闭处理：使用4%甲醛室温固定20 min，含0.1% Triton X-100的溶液室温透化15 min，5%牛血清白蛋白溶液室温封闭非特异性位点。细胞与一抗（波形蛋白鼠lgG1，稀释比例1∶200）在4 ℃下避光孵育过夜，PBS清洗后加入按1∶100稀释的FITC标记荧光二抗，洗涤，加入DAPI染核10 min，洗涤3次，封片。使用共聚焦显微镜观察并采集图像。实验重复3次。

1.7 心肌成纤维细胞增殖情况评估

将心肌成纤维细胞以5×105个/孔的密度均匀接种于6孔板中，每组设置3个复孔，于37 ℃培养箱中贴壁培养24 h。随后吸出旧培养液并加入工作溶液，继续培养24 h。处理结束后，每孔加入10 µmol/L EdU溶液，继续孵育2 h；弃去培养基并洗涤细胞，并经4%多聚甲醛固定15 min。固定后再次洗涤，加入0.5% Triton X-100透化20 min，使用Click反应液避光孵育30 min，以标记EdU掺入的DNA。反应结束后，使用Hoechst 33342对细胞核染色10 min。最后于倒置荧光显微镜下随机选取视野采集图像，并统计EdU阳性细胞比例，以评估细胞增殖情况。

1.8 RT-qPCR法检测相关基因

消化后的心肌成纤维细胞总RNA使用TransZol Up Plus RNA Kit试剂盒进行提取。反转录过程使用Hiscript ⅡQ RT SuperMix for qPCR（+gDNA Wiper）进行。将获得的cDNA中20 ng用于RT-qPCR检测。PCR反应体系20 µl：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 µl，正、反向引物各0.4 µl，cDNA 1 µl，RNase Free H2O 8.2 µl；反应条件：初始变性95 ℃、30 s；95 ℃变性10 s，40个循环；60℃延伸10 s。以β-actin作为内参，通过2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。实验重复3次。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

基因名称引物序列（5’→3’）引物长度（bp）趋化素正向引物：CGGTGTGGACAGTGCTGATGAC22反向引物：TCCGCTTCCTCCCATTTGGTTTG23反向引物：GCAGCGGTATGTGTCGAAGCC21β-actin正向引物：CTGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC22 CMKLR1正向引物：GCACCAGCCACGGGAAGATAAC22反向引物：GATCAGGAAGCCACAGAGGAAGC23 PCNA正向引物：CGGCGTGAACCTACAGAGCATG22反向引物：GGAACCGCTCATTGCCGATAGTG23

1.9 Western blot法检测相关蛋白

心肌成纤维细胞提取总蛋白，进行变性、定量、电泳、转膜。孵育特异性一抗（抗p-Akt、p-PI3K、p-NF-κB、Akt、PI3K、NF-κB、PCNA、趋化素、CMKLR1及β-actin，稀释1∶1 000），0.1% Tween-20洗涤3次。TBS与二抗（稀释1∶1 000）在室温下孵育1 h，洗涤5次，免疫反应性蛋白质使用增强型化学发光系统进行检测。实验重复3次。

1.10 统计学方法

采用SPSS 27.0统计学软件进行数据分析，Graph-Pad Prism v9.0 软件进行制图。计量资料用均数±标准差（）表示，比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌成纤维细胞的鉴定

心肌成纤维细胞呈波形蛋白阳性，绿色荧光信号主要定位于胞浆；细胞核经DAPI染色显示为蓝色。消化传代后的心肌成纤维细胞体积增大，形态更为舒展，胞体丰满，可见明显延展的长梭形突起，相邻细胞突起间常相互连接，形成网状结构。见图1。

图1 心肌成纤维细胞鉴定（×400）

2.2 心肌成纤维细胞增殖模型构建情况

与对照组比较，醛固酮组细胞增殖率，以及趋化素、CMKLR1、PCNA蛋白和mRNA表达升高（P＜0.05）。见图2、3。

图2 两组细胞增殖率比较

图3 两组趋化素、CMKLR1、PCNA蛋白和mRNA表达比较

2.3 外源性趋化素对心肌成纤维细胞增殖和CMKLR1、PCNA蛋白表达的影响

与对照组比较，各外源性趋化素组细胞增殖率及CMKLR1、PCNA蛋白表达升高（P＜0.05）。见图4、5。外源性趋化素浓度为100 ng/ml时，细胞增殖率、CMKLR1及PCNA蛋白表达最高，因此选择该浓度进行后行实验。

图4 各外源性趋化素组细胞增殖率比较

图5 各外源性趋化素组CMKLR1、PCNA蛋白表达比较

2.4 通路抑制剂对心肌成纤维细胞增殖和CMKLR1、PCNA蛋白表达的影响

与对照组比较，趋化素组细胞增殖率升高（P＜0.05）；LY294002组细胞增殖率降低（P＜0.05）。与趋化素组比较，趋化素+LY294002组细胞增殖率降低（P＜0.05）。见图6。

图6 各组细胞增殖率比较

与对照组比较，趋化素组p-PI3K、p-Akt、p-NF-κB、PCNA蛋白表达升高（P＜0.05）；LY294002组p-PI3K、p-Akt、p-NF-κB、PCNA蛋白表达降低（P＜0.05）；PDTC组p-NF-κB蛋白表达降低（P＜0.05）。与趋化组比较，趋化素+LY294002组p-PI3K、p-Akt、p-NF-κB、PCNA蛋白表达降低（P＜0.05）；趋化素+PDTC组p-NF-κB蛋白表达降低（P＜0.05）。见图7。

图7 各组PI3K/Akt/NF-κB通路蛋白表达比较

3 讨论

心肌纤维化是心力衰竭发生、发展中的核心病理过程。在早期常呈隐匿性进展，患者多无明显临床症状，待病情进展至心力衰竭等终末阶段时，心肌的结构重塑往往已难以逆转，严重制约治疗效果并影响患者预后。因此，在心肌纤维化进入不可逆阶段前，深入探索其分子机制，寻找早期干预关键靶点，对遏制心力衰竭进程至关重要。趋化素已被证实与多种心血管疾病密切相关，其可调控血管内皮细胞的增殖、迁移等过程。研究显示，趋化素可能通过降低蛋白激酶磷酸化和增加胱天蛋白酶活性来抑制心肌细胞的活力，提示其参与心肌重构[14]。因此，趋化素有望成为心力衰竭早期预防的生物标志物。本研究结果显示，趋化素在醛固酮诱导的心肌成纤维细胞增殖模型中上调，提示其可能参与心肌纤维化的发生、发展。

脂肪组织分泌多种脂肪因子，参与调控葡萄糖代谢、免疫炎症反应等关键生理过程[15]。冠心病患者心外膜脂肪组织中趋化素水平升高[16]。趋化素可通过激活MAPK-ERK1/2、PI3K及AMPK等信号通路，促进细胞外基质积累，从而驱动心肌纤维化的发生与发展[17-18]。此外，趋化素可促进肝周围脂肪组织产生大量非酯化脂肪酸，导致肝细胞脂肪变性进而诱发肝纤维化的发生[19]。糖尿病肾病小鼠模型中趋化素含量与该区域纤维化程度呈正相关[20]。研究发现，在扩张型心肌病大鼠的心肌组织中，趋化素和CMKLR1的表达均上调[8,21-22]。趋化素主要通过其受体CMKLR1发挥作用，CMKLR1受体拮抗剂α-NETA可阻断趋化素诱导的细胞迁移[23-24]。CMKLR1因具有良好的药理学特性，已成为特异性药物靶点[25]。PI3K/Akt信号通路与心血管系统疾病密切相关[26-27]。脂肪细胞因子内皮素通过激活PI3K/Akt信号通路刺激成年大鼠心肌成纤维细胞的增殖和迁移[28-29]。LY294002通过抑制PI3K信号通路可预防正常血压和高血压患者缺血/再灌注诱导的心功能障碍[30]。此外，LY294002还抑制趋化素诱导的心肌成纤维细胞迁移[23]。在心力衰竭模型中，TLR4/NF-κB信号通路被激活，促进肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β等因子表达，导致心肌细胞凋亡[31]。研究显示，MAPK和PI3K/Akt信号通路参与趋化素诱导的NF-κB激活[32]。本研究发现，使用外源性趋化素处理心肌成纤维细胞可促进其增殖，并且增加CMKLR1表达，提示趋化素可能通过CMKLR1发挥作用；同时，趋化素可激活PI3K/Akt/NF-κB信号通路相关蛋白的表达，并且加入LY294002后逆转趋化素的激活及增殖作用，提示趋化素可能通过影响PI3K/Akt/NF-κB通路影响心肌成纤维细胞的增殖作用；加入PDTC后逆转趋化素对NF-κB通路的激活作用，而对PI3K/Akt通路无抑制作用，提示PI3K/Akt位于NF-κB上游。

综上所述，本研究结果显示，趋化素在心肌成纤维细胞中具有促纤维化的作用；趋化素/CMKLR1轴可能通过PI3K/Akt/NF-κB信号通路影响心肌成纤维细胞增殖。趋化素/CMKLR1轴有望成为心肌纤维化治疗的分子靶点，有必要对其进行深入研究。

本研究仍存在一定的局限性：关于趋化素通过PI3K/Akt/NF-κB信号通路促进纤维化的机制，未来需进一步完善研究，如加入PDTC后再次对成纤维细胞进行细胞增殖实验，进一步探索该通路与其他信号通路的相互作用，并研究潜在的药物干预策略；尽管体外心肌成纤维细胞模型已取得一定进展，但由于其无法完全模拟体内环境，未来研究将转向构建动物模型（尤其是转基因小鼠模型）和体外三维培养模型，以更接近真实的心脏微环境；为验证趋化素/CMKLR1轴在心肌纤维化中的临床意义，计划开展临床样本分析，比较健康人群与心力衰竭患者中相关指标的表达水平，并探索其与心脏功能的相关性。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Exploration the effect and mechanism of chemerin on myocardial fibrosis based on PI3K/Akt/NF-κB signaling pathway

CAI Rui WANG Yaling

Department of Cardiology, the Second Hospital of Hebei Medical University, Hebei Province, Shijiazhuang 050000,China

[Abstract] Objective To investigate the effect of chemerin on myocardial fibrosis based on PI3K/Akt/NF-κB signaling pathway. Methods Primary myocardial fibrosis were isolated and cultured from 2-3-day-old SPF-grade male SD rats.An aldosterone-induced cell proliferation model was established and the proliferative effect of aldosterone on myocardial fibrosis was observed. The cells were divided into control group, chemerin group, LY294002 group, PDTC group,chemerin+LY294004 group, and chemerin+PDTC group. Myocardial fibrosis were identified by cellular immunofluorescence; cell proliferation was detected by the EdU method; the expressions of chemerin, CMKLR1, and PCNA mRNA were detected by RT-qPCR; and the expressions of chemerin, CMKLR1, PCNA, and pathway proteins were detected by Western blot. Results Myocardial fibrosis were identified as vimentin positive. Compared with the control group, the cell proliferation rate, as well as the expressions of chemerin, CMKLR1, and PCNA protein and mRNA in the aldosterone group were increased (P＜0.05). Compared with the control group, the cell proliferation rate in the chemerin group increased (P＜0.05); the cells proliferation rate in the LY294002 group decreased (P＜0.05); compared with the chemerin group, the cell proliferation rate in the chemerin+LY294002 group decreased (P＜0.05). Compared with the control group, the expressions of p-PI3K, p-Akt, p-NF-κB, and PCNA protein in the chemerin group increased (P＜0.05);the expressions of p-PI3K, p-Akt, p-NF-κB, and PCNA protein in the LY294002 group decreased (P＜0.05); the expression of p-NF-κB protein in the PDTC group decreased (P＜0.05). Compared with the chemerin group, the expressions of p-PI3K, p-Akt, p-NF-κB, and PCNA protein in the chemerin+LY294002 group decreased (P＜0.05);the expression of p-NF-κB protein in the chemerin+PDTC group decreased (P＜0.05). Conclusion Chemerin may promote the proliferation of myocardial fibrosis through the PI3K/Akt/NF-κB signaling pathway. Targeting the chemerin/CMKLR1 axis and the PI3K/Akt/NF-κB signaling pathway may provide new therapeutic strategies for reversing or preventing myocardial fibrosis.

[Key words] CMKLR1; PI3K/Akt signaling pathway; NF-κB signaling pathway; Myocardial fibrosis

[中图分类号] R542.2

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）06（a）-0006-08

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25080537

[基金项目] 河北省卫生健康委员会医学科学研究课题（20221114）。

[作者简介] 蔡瑞（1997.7-），女，硕士，主要从事心力衰竭机制研究工作。

[通讯作者] 王亚玲（1981.3-），女，博士，副主任医师，主要从事心脏电生理的基础及临床工作。

（收稿日期：2025-08-08）

（修回日期：2026-02-05）