柯萨奇病毒B组5型（Coxsackievirus B5，CVB5）属于小核糖核酸病毒科肠道病毒B属（enterovirus B，EVB），是一种无包膜单链正链RNA病毒[1]。其基因组约7 400个核苷酸，包含5’非编码区、开放阅读框和3’非编码区。开放阅读框编码的前聚蛋白被加工为多聚蛋白前体P1、P2、P3，进一步切割成4种结构蛋白（VP4、VP2、VP3、VP1）和7种非结构蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D）[2-3]。结构蛋白参与病毒组装，非结构蛋白则参与RNA复制、蛋白加工、诱导凋亡及抑制宿主翻译[4-5]。该病毒非结构区域易发生基因重组，可能增强毒力与传播能力[6]。

多数CVB5感染无症状，但也可引起严重神经系统并发症，如脑膜炎、脑炎、瘫痪及危及生命的新生儿感染[7]。全球多地区均报告过CVB5引发的无菌性脑膜炎疫情。2008年以来，中国手足口病疫情中常检出CVB5，且其在2009年与2012年曾引起无菌性脑膜炎暴发。CVB5在非结构区（P2、P3）频繁发生重组，是病毒进化及适应宿主免疫的重要机制，可导致抗原性改变、致病性增强或传播扩大，对疫苗研发与防控策略产生影响。中国云南为肠道病毒流行热点地区，解析当地CVB5基因组特征与重组动态对揭示其进化规律、预警流行风险具有重要意义。本研究报道并分析2022年从中国西南地区2例手足口病儿童粪便中分离出的两株新型重组CVB5的全基因组序列，以增进对CVB5进化的理解，并补充基因库中该病毒的基因组数据。

1 材料与方法

1.1 样品及细胞

本研究已获昆明市妇幼保健院伦理委员会批准（2022-2-17）。2022年在昆明市妇幼保健院从2例年龄1.6、6.0岁的手足口病患儿粪便中采集样本。通过Vero细胞分离出两种菌株，并储存于-80℃的环境中。Vero细胞由中国医学科学院医学生物学研究所保存并提供。

1.2 主要试剂

Axygen Body Fluid viral DNA/RNA Miniprep Kit试剂盒（批号：29217KC5）购自美国Axygen公司；Prime-Script™ One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒（批号：AN82583A）、DL2000 DNA Marker（批号：AM11312A）购自宝生物工程（大连）有限公司；新生牛血清购自兰州民海生物工程有限公司；MEM溶液、DMEM溶液、3%谷氨酰胺溶液、6.6%碳酸氢钠溶液、0.01 mol/L PBS（pH 7.4）溶液、0.125%胰蛋白酶溶液由中国医学科学院医学生物学研究所中心供应室提供；Gene-Green核酸染料（批号：SD0531）购自北京天根生物有限公司。

1.3 病毒分离

将收集的粪便样品用PBS预处理制备成10%混悬液，离心上清液经除菌过滤后，接种至Vero细胞进行病毒分离，收集培养液并进行3次冻融循环，产生典型的肠道病毒细胞病变效应收获培养上清液，保存于-80 ℃。

1.4 RT-PCR和测序

使用Axygen Body Fluid viral DNA/RNA Miniprep Kit按说明提取病毒RNA，并用PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit Ver.2和引物14 AN88（5’- TACTGGACC ACCTGGNGGNA-3’）及AN89（5’- CCAGCACTGAC AGCAGYNG-3’）[8]作为模板，扩增病毒序列。RT-PCR阳性产物被送往昆明青科生物科技有限公司使用ABI 3130遗传分析仪（美国Applied Biosystems公司）进行测序。随后，通过在线肠病毒基因分型工具确定病毒的血清型[9]。使用PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒进行2次全基因组PCR扩增。5’-UTR端扩增使用引物E201F（5’- TTAAAACAGCC TGTGGGTTG-3’）和CVB5N2R（5’- GCGCGGTCC TGTCGGCATTG-3’），3’-UTR端扩增使用引物CVB5N3F（5’-TATGTGAAAAGTTCAAACG-3’）和EV8R（5’-ACCGAATGCGGAGAATTTAC-3’）。全基因组的测序采用了“引物移步”策略[10]。本研究中使用的全部引物见表1。获得了2个双向序列，使用ABI 3130遗传分析仪进行测序。最后，采用DNA Star Lasergene 7.1软件对测序所得序列进行拼接，从而成功获得病毒的全基因组序列。

表1 全基因组扩增和测序的引物

引物名称引物序列（5’→3’）位置方向BOASGGTGCTCACTAGGAGGTCYCT3505-3484反向BOSGGYTAYATNCANTGYTGGTAYCARAC2324-2340正向E201FTTAAAACAGCCTGTGGGTTG1-20正向B5N2RCAATGGCCCTCTCCACCGC2483-2465反向B5N1rGTGGGTGCTTGCTCCGCA500-483反向B5N1fAGCTATTGGATTGGCCAT624-641正向B5N3FCCCACTGGTGTGACCGAGAG 3248-3267正向E208RACCGAATGCGGAGAATTTAC7401-7381反向B5N4FGACCAATGCTTGCAAAGGG 4078-4096正向B53006rTGGCCGTCGAGCATGACW6597-6579反向B54896rTCACAMCCAACTGCACTGCC6552-6533反向B5N7fCAATACCCCTTCCTTGTT7064-7081正向B5N5f1GCCATCCAATTCATCGAC4910-4927正向

1.5 序列与重组分析

核苷酸和氨基酸序列分析使用Geneious Basic 5.4.1 Beta软件完成。系统发育分析通过MEGA 7.0软件进行，采用Kimura两参数模型、邻接法，并进行1 000次自举复制。重组分析采用RDP、GeneGene、BootScan、Maxchi、Chimera、SiScan和3Seq这7种算法。当3个或更多算法得出的P值＜0.01时，重组事件被认为可靠。自举扫描分析在Simplot 3.5.1中使用Jukes-Cantor方法进行，每200个核苷酸窗口以20-nt的增量移动，并构建相似性图。序列比较则使用BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）软件完成。同时本研究中的两株CVB5分离株的完整基因组已提交至基因库，登录号为PP554886和PP554888。

1.6 序列比对与参考株选择

完成全基因组测序后，使用NCBI BLAST工具对所得序列进行初步比对，筛选出同源性最高的已知CVB5及EVB毒株作为参考序列。系统发育分析与重组分析中使用的参考株包括CVB5原型株Faulkner及近年来在基因库中发布的相关CVB5、E11、E16、E33等EVB毒株。

2 结果

2.1 病毒分离及VP1序列分析

从Vero细胞中获得了两株CVB5分离株（300/YN/CHN/2022和489/YN/CHN/2022），两个分离株的整个VP1序列（849个核苷酸）与CVB5菌株J126-YN-CHN-2022（LC791337，2022年在云南西南地区分离）的同源性最高。这两个分离株与CVB5原型福克纳菌株（1952年在美国分离）的整个VP1序列的核苷酸同源性分别为80.4%和80.6%，氨基酸同源性分别为95.4%和95.8%，并且与其他CVB5菌株的核苷酸和氨基酸同源性分别为81.4%~98.82%和98.2%~99.3%。两个云南分离株之间的整个VP1核苷酸和氨基酸同源性分别为99.3%和99.3%。两株分离株与从基因库获取的169个VP1序列的系统发育分析见图1。根据EV基因分型，平均截止分歧值约为15%的序列被视为同一基因型，CVB5菌株被分为4个基因型（A-D）。见表2。基因型D进一步细分为D1和D2亚型，基因型B则细分为B1、B2和B3亚型。基因型A和C的流行率有所下降，而基因型B和D的流行率则呈上升趋势，尤其是基因型B。在中国，大多数CVB5属于基因型B2。

图1 CVB5 VP1基因序列的系统进化树（邻接法）

表2 CVB5各基因型间VP1核苷酸同源性比较（%）

基因型ABCD A99.8~99.980.3~82.482.0~82.476.7~78.3 B84.6~99.381.4~83.177.0~80.1 C91.3~95.178.1~82.0 D84.9~99.2

注 CVB5:柯萨奇病毒B组5型。

2.2 全基因组序列分析

两株新分离的CVB5病毒株的完整基因组核苷酸和氨基酸序列分别与原始CVB5病毒株Faulkner及另外4种CVB5病毒株（登录号分别为PP554885、PP554887、PP554889、PP554890）的序列相似度分别为98.8%和98.9%。这些新病毒株的基因组核苷酸和氨基酸序列与2022年在中国西南部云南省从4例手足口病儿童粪便中分离出的4种CVB5病毒株（登录号分别为PP554885、PP554887、PP554889、PP554890）的序列进行比较，结果显示，其与原始CVB5病毒株Faulkner及4种新分离的CVB5病毒株基因组不同区域的核苷酸序列相似度分别为74.2%~83.3%和72.5%~98.9%，氨基酸序列相似度分别为90.7%~97.3%和89.3%~100.0%。见表3。

表3 两个重组分离株与原型菌株和4个CVB5分离株在所有测序基因组区域的核苷酸和氨基酸序列同一性（%）

基因组区域核苷酸一致性原型株氨基酸一致性核苷酸一致性其他CVB5分离株氨基酸一致性5’UTR83.2~83.3-97.3~98.9-VP478.7~79.292.8~97.193.7~97.694.2~100.0 VP281.1~81.497.397.8~98.396.6~100.0 VP381.2~81.796.6~97.197.5~98.797.9~99.6 VP180.4~80.695.4~95.897.5~98.298.9~99.32A78.692.797.3~98.298.0~99.32B77.4~77.895.4~97.396.6~97.698.0~99.02C80.1~81.695.5~96.687.9~89.297.0~99.13A80.195.5~96.679.4~80.192.1~93.33B74.2~75.890.7~95.572.7~77.389.3~96.83C77.0~77.596.7~97.377.0~78.195.1~97.43D79.8~79.996.3~96.579.6~80.395.7~96.33’UTR78.8~82.4-72.5~78.5-基因组80.495.9~96.090.5~90.897.6~97.8

注 “-”表示无数据。CVB5：柯萨奇病毒B组5型。

由于两个分离株在基因组核苷酸和氨基酸序列上具有高度相似性（分别为98.8%和98.9%），因此选择489/YN/CHN/2022菌株进行进一步分析。通过在线BLAST（https://blast.ncbi.nlm.gor）搜索，确定了与489/YN/CHN/2022菌株同源性最高的核苷酸序列。见表4。489/YN/CHN/2022菌株的P3区域与E11/Swab-12/HB.ES/CHN/2019菌株的P3区域最为相似；而3A至3D区域则与E16菌株510/YN/CHN/2010（2010年从中国1例手足口病患者中分离）、E33菌株GTM/CQU/2021-2（2012年从危地马拉受人类排泄物污染的环境中分离）、E11菌株Swab-4/HB.ES/CHN/2019（在中国分离）及CVB4菌株CVB4M063015（2015年从美国的生污水中分离）的P3区域最为相似。此外，489/YN/CHN/2022菌株的3’-UTR区域与E16菌株P85/2013/China（2013年从中国1例手足口病患者中分离）的3’-UTR区域最为相似，同源性达94.1%。

表4 489/YN/CHN/2022与基因库中其他肠道病毒（包括CVB5）核苷酸一致性分析

基因组区域菌株核苷酸一致性（%）基因登录号5’UTRCVB5/SJ0004098.12ON152868 VP4CVB5/18043/CQ/CHN/2018 95.65OP672309 VP2CVB5/SJ0004898.98ON152871 VP3CVB5/SJ0004198.46ON152870 VP1 CVB5/YN-01/CHN/202298.59OQ4082832ACVB5/SJ0004897.78ON1528712BCVB5/YN-01/CHN/202299.33OQ4082832CE30/TLTC/NM/CHN/201689.78MW0803773AE16/510/YN/CHN/201092.13MW4816333BE33/GTM/CQU/2021-289.39ON3831513CE11/Swab-4/HB.ES/CHN/201991.07MZ2296433DCVB4M06301587.92MG8458883’UTRE16/P85/2013/China94.06KP289436 GenomeCVB5/Swab/HB.ES/CHN/201991.70MZ229657 P1CVB5/SJ0004198.36ON152870 P2CVB5/18043/CQ/CHN/201891.29OP672309 P3E11/Swab-12/HB.ES/CHN/201988.69MZ229653

注 CVB5：柯萨奇病毒B组5型。

2.3 P1、P2和P3区域的系统进化分析

P1、P2和P3区域的系统发育树是基于基因库中所有CVB5菌株和其他EVB原型菌株构建的，还包括7个额外的EVB菌株（E11菌株Swab-12/HB.ES/CHN/2019、E16菌株510/YN/CHN/2010、E33菌株GTM/CQU/2021-2、E11菌株Swab-4/HB.ES/CHN/2019、CVB4菌株CVB4M063015，以及E16菌株P85/2013/China、E30/TLTC/NM/CHN/2016）。如图2所示，在P1区域，这两个新分离的CVB5菌株与所有CVB5菌株包括原型菌株Faulkner聚在一起。在P2区域，大多数CVB5菌株分为两个主要群组，少数CVB5菌株包括原型菌株Faulkner与其他EVB菌株聚在一起，形成了不同的小分支；但两个新的CVB5菌株与大多数中国菌株聚在一起，这些菌株属于两个主要群组之一。在P3区域，CVB5菌株与不同的EVB菌株聚在一起，形成了不同的群组。其中，大多数中国菌株与EV-B106/148/YN/CHN/2012（KF990476）聚在一起。然而，两个新的CVB5菌株与两个E11菌株（MZ229653/Swab-12/HB.ES/CHN/2019和MZ229643/Swab-4/HB.ES/CHN/2019）、1个CVB4菌株（MG845888/B4M063015）及3个CVB5菌株（MZ229657/Swab/HB.HS/CHN/2019、OP441386/ 13351/HB/CHN/2013和OP672304/16074/XJ/CHN/2016）聚在一起。

图2 基于基因库中所有CVB5毒株以及EVB原型毒株的P1、P2和P3区域构建的系统发育树

2.4 重组分析

在3’-UTR区域，菌株489/YN/CHN/2022与中国的E16菌株P85/2013/China的相似度最高（94.1%）。通过Simplot和Bootscan分析进一步证实菌株489/YN/CHN/2022基因组序列中的几个重组事件。见图3。此外，RDP4分析显示，489/YN/CHN/2022分离株经历了与E11/Swab-4/HB.ES/CHN/2019菌株的重组事件。见图4。这些发现显示CVB5菌株之间可能存在一些潜在的重组事件，包括两个新分离株及其他EVB血清型。

图3 489/YN/CHN/2022分离株与EVB各血清型全基因组序列Simplot和Bootscan分析

图4 两株CVB5分离株的RDP分析

3 讨论

灭活肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）疫苗在中国的引入，导致手足口病的主要病原体发生了变化：柯萨奇病毒A6型（Coxsackievirus A6，CVA6）取代了EV71成为手足口病的主要病原体[11]。而CVB5是无菌性脑膜炎暴发的常见原因，自2008年手足口病暴发以来，CVB5一直存在于手足口病病例中。2009年，CVB5成为山东省手足口病的主要病原体。最初，手足口病被认为是由EVA血清型引起的，但CVB1、CVB4和CVB5等CVB也是重要的病原体。目前实验室测试主要集中在EV71、CVA16、CVA6和CVA10上，为了更好地预防和控制手足口病，需要对所有潜在的手足口病病原体包括CVB5进行监测。

RNA病毒的RNA聚合酶不具备校正功能。自1951年分离出Faulkner菌株以来，CVB5的平均进化率为3.718×10-3次/年[12]。基于VP1区域，CVB5被分为4个基因组群：A、B、C和D。此外，中国CVB5菌株主要属于B群，本研究中的两个云南分离株也属于B群。基因库中可用的中国CVB5菌株的全基因组分别显示出18.75%（16.9%~20.6%）和4.00%（2.8%~5.2%）的核苷酸和氨基酸序列差异，表明中国菌株随着环境的变化而进化。

重组是肠道病毒的主要进化机制，尤其在非结构区域频繁发生，特别是在EVB30和EVB31中[13]。这种重组可以产生新的病毒变种，可能导致相关疾病暴发。因此，通过BLAST在线方法、系统发育分析、Simplot 3.5.1和RDP软件的分析，发现潜在的重组体489/YN/CHN/2022可能是由CVB5与E11（或CVB4、E16或E33）之间的多次重组事件产生的。由于这些病毒具有极高的序列同源性，其可能是重组的亲本。埃可病毒在CVB的自然重组中发挥重要作用，其中CVB5是导致无菌性脑膜炎暴发最常见的病原体之一，常与其他EVBs如CVB4、E16、E11和E33一起出现在手足口病病例中[14-15]。2010年，中国从手足口病患者中分离出了E16菌株510/YN/CHN/2010；2012年，危地马拉从人类排泄物的环境水中分离出了E33菌株GTM/CQU/2021-2；2013年，日本从生污水中分离出了CVB4菌株B406；2019年，中国从咽拭子中分离出E11/Swab-4/HB.ES/CHN/2019。埃可病毒促进了CVB的自然重组，CVB5可能通过重组引起疾病暴发。云南作为中国热门旅游目的地之一，与其他国家的人口频繁交流，也为病毒重组提供了充足机会。

综上所述，本研究发现了两种与手足口病相关的新型CVB5重组菌株，重组发生在非结构区域。为了更好地理解CVB5的流行病学，需要对更多序列进行研究。由于这些菌株在手足口病之外的致病性日益增加，其他致病性也值得进一步研究。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Analysis of the etiologic characteristics of two novel recombinant strains of Coxsackievirus B5

LI Xiang1* CHU Zhaoyang1* YANG Hengli1 CHEN Junwei1 FENG Changzeng1 LI Li2 LIU Jiansheng1 MA Shaohui1▲

1.Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Yunnan Province,Kunming 650118, China; 2.Department of Clinical Laboratory, Kunming Maternal and Child Health Hospital Laboratory, Yunnan Province, Kunming 650031, China

[Abstract] Objective To analyze the whole genome genetic characteristics of two isolates of Coxsackievirus B5 (CVB5)in Yunnan Province, and to provide a scientific basis for dynamically grasping the genetic evolution law and epidemic trend of CVB5 in Yunnan Province. Methods Virus isolation was carried out using vaccine matrix cells Vero and RD.RNA from the cytopathic products was extracted for reverse transcription polymerase chain reaction and sequencing.Software such as MEGA 7.0, Geneious 10.0, and Simplot 3.5.1 were used to analyze the whole genome sequences of the isolated strains. Results The whole genome sequences of two newly isolated strains, 489/YN/CHN/2022 and 300/YN/CHN/2022 in 2022, were determined, and they were classified into subtype B2 with other Chinese strains. The nucleotide and amino acid sequences of the isolates had 82.1%-86.4% and 96.6%-97.2% homology with the prototype strain respectively, and the mutual homology was 87.1% and 97.2% respectively. Recombination analysis showed that these two CVB5 strains had inter-type recombination with CVB5 and CVE11 in the 2C and 3D regions respectively. Conclusion The isolates 489/YN/CHN/2022 and 300/YN/CHN/2022 are type B2 of CVB5 and are two recombinant strains.

[Key words] Enterovirus; Coxsackievirus B5; Whole genome; Genetic evolutionary analysis; Recombination analysis

[中图分类号] R373.2

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）06（a）-0014-07

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25091835

[基金项目] 云南省重大科技专项计划项目（202202AA100016）。

[作者简介] 李响（2002-），女，北京协和医学院医学生物学研究所2024级病原生物学专业在读硕士研究生，主要从事肠道病毒应用基础研究工作。楚昭阳（2001-），女，北京协和医学院医学生物学研究所2023级病原生物学专业在读硕士研究生，主要从事肠道病毒应用基础研究工作。

*具有同等贡献

▲通讯作者

（收稿日期：2025-09-24）

（修回日期：2026-01-28）