胃癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率均位居前列，尤其在东亚地区构成了重大的公共卫生挑战[1]。尽管近年来在手术、化疗、靶向及免疫治疗方面取得了一定进展，但患者的预后仍然较差，晚期患者5年生存率为20%～30%[2]。因此，需要深入探索胃癌发生和发展的分子机制。组织因子（tissue factor，TF）也称为凝血因子Ⅲ，被认为是外源性凝血途径的启动子。然而，本课题组前期研究发现TF在多种恶性肿瘤（如胰腺癌、胃癌、结直肠癌和乳腺癌）中异常高表达，并调控肿瘤的血管生成、侵袭转移等过程[3-5]。已报道TF表达在胃癌中上调与临床分期和预后差相关，然而，目前TF驱动胃癌恶性进展的分子机制尚不清楚[6]。

肿瘤细胞即使在氧气充足的情况下，也倾向于将葡萄糖代谢为乳酸，这种独特的代谢模式被称为“有氧糖酵解”或“Warburg效应”[7]。其不仅为快速增殖的肿瘤细胞提供能量和生物合成前体，还通过酸化微环境促进免疫逃逸和侵袭转移[8]。近年来研究发现，Wnt/β-catenin信号通路是肿瘤代谢重编程的关键调控者，能够转录上调多种糖酵解关键酶（如GLUT1、LDHA、PKM2）的表达，从而强化Warburg效应[9-10]。然而，TF在两者的关系尚不清楚。因此，本研究旨在探讨在胃癌进展中TF、Wnt/β-catenin信号通路与糖酵解之间的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂

从中国科学院细胞库获取HEK-293T细胞及人胃癌细胞系MKN45和AGS细胞并由甘肃省环境肿瘤实验室保存。TF及TCF7/2相关慢病毒载体由上海赛业生物科技合成。Trizol试剂（货号：AG21101）、RNA反转录（货号：AG11705）及荧光定量试剂盒（货号：AG11701）购于艾科瑞生物工程有限公司。ATP试剂盒（货号：S0027）和乳酸试剂盒（货号：S0208S）由上海碧云天生物技术有限公司提供。pcDNA3.1-TCF7L2过表达载体及pGL4.10-TF-（不同位点）-promoter-Luc报告质粒由苏州吉玛基因公司提供。荧光素酶检测试剂盒（货号：E1910）购于美国Promega公司。

1.2 细胞培养与分组

将从中国科学院细胞库获取的HEK-293T细胞及人胃癌细胞系MKN45和AGS细胞置于含有1%青霉素-链霉素混合液（货号：C0222，上海碧云天生物技术有限公司）和10%胎牛血清（货号：SV30087.03，美国Hyclone公司）的DMEM培养基中，在37 ℃、5%CO2条件下进行培养。将细胞接种至6孔板后，待细胞融合度达到20%～30%时，使用慢病毒载体转染。MKN45胃癌细胞转染下调TF的慢病毒设为sh-TF#1和sh-TF#2组，对照为sh-Ctrl组，AGS转染上调TF的慢病毒设为TF组，对照为Vector组，同理设置MKN45转染TCF7L2慢病毒细胞，下调TCF7L2的慢病毒设为sh-TCF7L2#1和sh-TCF7L2#2组，对照为sh-Ctrl组，AGS转染上调TCF7L2的慢病毒设为TCF7L2组，对照为Vector组，用于后续实验。所使用的shRNA序列如下：sh-TF#1为5’-CACCGGATGTCATCTTTGTAT-3’；sh-TF#2为5’-TCCCTGGATTATGCAAAGAAA-3’；sh-TCF7L2#1为5’-AGAGAAGAGCAAGCGAAATAC-3’；sh-TCF7L2#2为5’-CCTTTCAC TTCCTCCGATTAC-3’。培养HEK-293T细胞，后续进行双荧光素酶检测。

1.3 RT-qPCR法

对胃癌细胞使用Trizol试剂提取总RNA，并将其反转录为cDNA。随后，采用根据SYBR®Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒说明书进行基因扩增，PCR反应体系（20 µl），反应条件：Stage 1为95 ℃、30 s、1个循环；Stage 2为95 ℃、5 s、40个循环；Stage 3为60 ℃、30 s。反应体系：2×SYBR Green Pro Taq HS 10 µl、cDNA模板2 µl，Primer F（10 µmol/L）0.4 µl，Primer R（10 µmol/L）0.4 µl，ROX Reference Dye（20 µmol/L）0.4 µl，RNase free water 6.8 µl，以GAPDH作为内参。实验重复3次。基因的相对表达量通过2-ΔΔCt法进行计算。靶基因的引物设计如下：TF正向引物为5’-CAAACCCGTCAATCAAGTCTAC-3’；TF反向引物为5’-GCTTCACATCCTTCACAATCTC-3’；GAPDH正向引物为5’-CATGAGAAGTATGACAACA GCCT-3’；GAPDH反向引物为5’-AGTCCTTCC ACGATACCAAAGT-3’。

1.4 Western blot法

使用BCA蛋白浓度检测试剂盒（货号：P0010S，上海碧云天生物技术有限公司）测定提取的总蛋白浓度，随后通过SDS-PAGE凝胶电泳进行分离，并转至PVDF膜。封闭处理后，依次与一抗、二抗进行孵育，最终采用多功能成像系统（型号：5200，上海天能生命科学有限公司）进行分析。本实验所用一抗：抗TF抗体（1∶1 000，货号：sc-374441，美国Santa Cruz公司），抗β-catenin抗体（1∶5 000，货号：51067-2-AP，武汉三鹰生物技术有限公司）、抗TCF7L2抗体（1∶1 000，货号：TCF7L2，美国Santa Cruz公司）、抗MMP-9抗体（1∶1 000，货号：10375-2-AP，武汉三鹰生物技术有限公司）、Cyclin D1抗体（1∶5 000，货号：60186-1-Ig，武汉三鹰生物技术有限公司）、内参GAPDH（1∶10 000，货号：60004-1-Ig，武汉三鹰生物技术有限公司）、鼠二抗（1∶5 000，货号：SA00001-2，武汉三鹰生物技术有限公司）和兔二抗（1∶5 000，货号：SA00001-1，武汉三鹰生物技术有限公司）。

1.5 细胞克隆增殖实验

以每孔500个细胞的密度，将实验所需的细胞均匀接种于6孔板中，每组设置复孔数3个，随后将接种好的细胞置于恒温培养箱中进行为期14 d的持续培养。待培养周期结束后，采用固定染色技术对细胞进行处理，以便于后续观察和分析。最后，通过显微镜观察并统计每个孔中形成的克隆数量，以评估细胞的克隆形成能力。

1.6 细胞侵袭实验

在实验操作过程中，首先每组设置复孔数3个，将下室注入含有10%胎牛血清的培养基。与此同时，上室填充用Matrigel进行包被的无血清培养基。每个上室中均均匀接种了1×104个细胞，确保细胞密度适中，以便于后续的观察和数据分析。细胞逐渐穿透膜层侵入下室后进行有效固定。随后，对这些已侵入的细胞进行染色处理，使其在显微镜下清晰可见。最终，通过精确计数来测定细胞的侵入数量，从而评估细胞的侵袭能力。

1.7 伤口愈合实验

将细胞接种于6孔板中，并培养至细胞完全融合形成单层。每组设置复孔数3个，随后，使用200 µl的微量移液枪头在细胞层上划出清晰的划痕。划痕完成后，用磷酸盐缓冲液缓慢且仔细地冲洗细胞层，以去除因划痕而脱落的细胞碎片。为了观察和记录细胞愈合过程，分别在0 h和24 h使用显微镜拍摄划痕区域的细胞愈合情况，以便对比分析细胞迁移和修复的能力。

1.8 ATP及乳酸检测实验

将细胞接种于6孔板中并培养至细胞完全融合，每组设置复孔数3个，细胞消化后置于冰块上使用超声波细胞破碎仪（型号：JY92-IIN，上海净信实业有限公司）破碎细胞。后续ATP及乳酸的测定均严格按照各自说明书进行操作。

1.9 生物信息学分析

通过NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）检索TF启动子序列，该序列定位于转录起始位点上游2 000 bp及下游100 bp的区域。基于TF基因启动子序列，JASPAR数据库（https：//jaspar.elixir.no/）预测TCF7L2转录因子的潜在靶位点。

1.10 双荧光素酶检测

通过JASPAR数据库预测TCF7L2与TF启动子的结合位点，选取高评分位点进行验证。构建pcDNA-3.1-vector、pcDNA3.1-TCF7L2过表达载体及pGL4.10-TF-（sit1、sit2、sit3和sit4）-promoter-Luc报告质粒，以pRL-TK作为内参质粒。将HEK-293T细胞接种于12孔板（60%～70%融合度），每组设置3个复孔。①空载体对照组：每孔共转染 pcDNA-3.1-vector（过表达载体对照）+各pGL4.10-TF-（Site1-Site4）-promoter-Luc + pRL-TK；②TCF7L2过表达组：每孔共转染pcDNA3.1-TCF7L2（过表达载体）+各pGL4.10-TF-（Site1-Site4）-promoter-Luc + pRL-TK。使用Lipofectamine 2000进行质粒转染，培养到达预定时间点后收集细胞用于后续检测。在4 ℃、2 000 r/min（离心半径10cm）条件下离心5 min收集细胞，用PBS洗涤2次，每孔加入100 µl 1×PLB，置于摇床上裂解15 min。随后在4 ℃、12 000 r/min（离心半径10 cm）条件下离心10 min，取上清液转移至新的EP管中。在96孔板中，每孔加入100 µl Luciferase Assay Reagent Ⅱ和20 µl样品，测定550～570 nm处的OD值（萤火虫荧光素酶）；再加入100 µl Stop & Glo® Reagent混匀，测定460～540 nm波长处的光密度值（海肾荧光素酶）。计算相对荧光强度（萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶），以空载体对照组为参照，比较 TCF7L2 过表达组在不同结合位点的荧光素酶活性差异，实验独立重复3次。

1.11 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0.2软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 下调TF抑制胃癌细胞的增殖、侵袭与迁移能力

在MKN45细胞系中成功构建了TF基因下调的稳定转染株。与sh-Ctrl组比较，sh-TF#1组和sh-TF#2组TF蛋白表达水平和mRNA表达量降低，细胞的增殖能力、侵袭和迁移能力显著减弱（P＜0.01）。见图1。

图1 下调TF抑制胃癌细胞的增殖、侵袭与迁移能力（n=3）

2.2 过表达TF促进胃癌细胞的增殖、侵袭与迁移能力

在AGS细胞系中成功构建了TF基因过表达的稳转株。与Vector组比较，TF组TF蛋白表达水平和mRNA表达量升高，细胞的增殖能力、侵袭及迁移能力显著增强（P＜0.01）。见图2。

图2 过表达TF促进胃癌细胞的增殖、侵袭与迁移能力（n=3）

2.3 下调TF抑制胃癌细胞糖酵解的能力

在MKN45细胞中，与sh-Ctrl组比较，sh-TF#1组和sh-TF#2组细胞内乳酸水平显著下降，ATP水平显著升高（P＜0.05）。见图3。

图3 下调TF抑制MKN45胃癌细胞的糖酵解能力（n=3）

2.4 过表达TF促进胃癌细胞糖酵解的能力

在AGS细胞中，与Vector组比较，TF组细胞内的乳酸水平显著升高，ATP水平显著降低（P＜0.05）。见图4。

图4 过表达TF促进AGS胃癌细胞的糖酵解能力（n=3）

2.5 TF激活胃癌细胞的Wnt/β-catenin信号通路

在MKN45细胞中，与sh-Ctrl组比较，sh-TF#1组和sh-TF#2组β-catenin、TCF7L2、MMP-9和Cyclin D1蛋白表达水平下降（P＜0.01）。相反，在AGS细胞中，与Vector组比较，TF组β-catenin、TCF7L2、MMP-9和Cyclin D1蛋白表达水平升高（P＜0.01）。见图5。

图5 在胃癌细胞中TF激活Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路（n=3）

2.6 TCF7L2正调控TF基因及蛋白的表达

在MKN45及AGS细胞中，与sh-Ctrl组比较，sh-TCF7L2#1组和sh-TCF7L2#2组TCF7L2蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）；与Vector组比较，TCF7L2组TCF7L2蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），提示病毒转染成功。在MKN45及AGS细胞中，与sh-Ctrl组比较，sh-TCF7L2#1组和sh-TCF7L2#2组TF mRNA表达量和蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）；与Vector组比较，TCF7L2组TF mRNA表达量和蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）。见图6。

图6 TCF7L2调控TF基因及蛋白的表达

2.7 TF是TCF7L2转录调控的靶基因

在JASPAR网站上，通过预测筛选出评分较高的4个TCF7L2蛋白在TF启动子区可能结合的调控位点序列（分别命名为Site1、Site2、Site3、Site4），见图7A。仅在Site2位置中，与pcDNA-3.1-vector组比较，pcDNA-3.1-TCF7L2组荧光素酶活性显著升高（P＜0.01），见图7B。

图7 TCF7L2转录调控TF基因

3 讨论

本研究通过功能实验与分子机制探索，系统揭示了TF在胃癌恶性进展中的关键作用及其调控网络。主要获得以下几个结论：①TF表达水平与胃癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力密切相关；②TF可显著影响胃癌细胞的糖酵解代谢重编程过程；更重要的是，本研究发现TF与Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路之间存在正向调控环路，共同推动胃癌进展。这些发现为深入理解TF在胃癌发生和发展中的作用提供了新的实验依据和理论支持。

本实验结果显示，在MKN45细胞中下调TF表达可显著抑制细胞增殖、侵袭和迁移能力。相反，在AGS细胞中过表达TF则显著增强上述恶性表型。这一正反两方面的证据一致提示TF在胃癌细胞增殖与转移中发挥促进作用，与先前多项研究报道TF在多种实体瘤中异常高表达并与不良预后相关的结论相符[11-12]。值得注意的是，本研究不仅证实了TF对细胞行为学的影响，还进一步从代谢角度揭示其调控作用：TF表达水平与糖酵解活性呈正相关，下调TF导致乳酸生成减少和ATP水平变化，提示TF可能通过促进有氧糖酵解（Warburg效应）满足肿瘤细胞快速增殖的能量和生物合成需求。这一发现将TF的功能从传统的凝血相关作用拓展到肿瘤代谢领域，为理解TF的多功能角色提供了新视角。

机制层面，本研究报道了TF与Wnt/β-catenin信号通路在胃癌中存在交互作用。生物信息学分析与分子实验共同显示，TF表达与β-catenin、TCF7L2、MMP-9及Cyclin D1表达呈正相关。下调TF可降低这些关键分子的表达，而过表达TF则起到相反作用，提示TF是Wnt通路的上游调控因子。另一方面，TCF7L2作为Wnt通路的关键转录因子，可直接结合于TF启动子区域并调控其转录，由此构成一个“TF-β-catenin-TCF7L2-TF”的正反馈循环。该回路可能显著放大促癌信号，加速肿瘤进展与恶性转化。

近年来发现在胃癌中，包括Wnt/β-catenin在内的多条信号通路呈现异常激活状态，并在调控肿瘤细胞代谢重编程，特别是有氧糖酵解（Warburg效应）中发挥核心作用[13-14]。特别值得关注的是，本研究发现TF在连接Wnt信号通路与肿瘤代谢重编程中可发挥关键作用。Wnt/β-catenin通路已知可调控多种糖酵解相关基因的表达，如GLUT1、LDHA和PKM2等[15-17]。转录因子TCF7L2是Wnt/β-catenin信号通路的下游效应器，通过转录调控多种致癌基因，促进肿瘤进展[18-19]。本研究显示，TF可能作为Wnt通路的下游效应分子及上游调控因子，双向调节这一过程。一方面，TCF7L2直接调控TF的转录；另一方面，TF又能够增强Wnt通路的活性，进而强化对糖酵解相关基因的转录调控，形成一种放大型回路机制。这种正反馈环可能解释为何在某些胃癌病例中观察到异常活跃的糖酵解现象，即使在没有典型Wnt通路突变的情况下也是如此。

凝血系统与肿瘤发生和发展存在密切的双向联系[20]。TF作为凝血过程的主要启动因子，不仅通过激活蛋白酶活化受体等信号转导途径直接调控肿瘤细胞增殖、侵袭及血管生成，还通过形成肿瘤微血栓促进远处转移。此外，肿瘤细胞通过表达TF等多种促凝物质诱导高凝状态，而活化凝血过程又通过生成凝血酶、血小板激活等机制促进肿瘤进展。这种促凝与促瘤的恶性循环，使TF成为肿瘤治疗的重要靶点[21]。同时，考虑到TCF7L2与2型糖尿病的密切关系，以及本研究发现的TCF7L2-TF调控轴，可能部分解释了糖尿病与胃癌风险之间的流行病学关联，也可能为凝血系统-代谢性疾病-肿瘤之间的分子联系提供了新的解释[22-23]。

本研究仍存在一定的局限性：首先，所有实验均基于细胞系进行，其结果仍需在动物模型和临床样本中进一步验证；其次，尽管已明确TF与Wnt通路之间的正反馈关系，但该回路在其他胃癌亚型及转移过程中的作用尚待深入探讨；最后，TF调控糖酵解的具体下游效应分子及其与上皮到间质细胞转化间的因果联系仍需进一步阐明。

综上所述，本研究系统揭示了TF通过调控细胞增殖、侵袭和糖酵解过程促进胃癌进展，其作用机制与激活Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路及形成正反馈环路密切相关。这些发现为胃癌的分子靶向治疗提供了新的思路和潜在靶点。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Role of tissue factor in glycolysis and progression of gastric cancer via the Wnt/β-catenin pathway

KANG Xiaojuan 1 LI Haiyuan 2 XIANG Lin1 YU Yang1

1.The Second Clinical Medical College, Lanzhou University, Gansu Province, Lanzhou 730000, China; 2.Department of Surgical Oncology, the Second Hospital of Lanzhou University, Gansu Province, Lanzhou 730030, China

[Abstract] Objective To investigate the biological function of tissue factor (TF) in gastric cancer progression and elucidate its mechanism in promoting malignant phenotypes of gastric cancer cells by regulating the Wnt/β-catenin signaling pathway and glycolytic metabolism. Methods Lentiviral transduction was employed to engineer TF-knockdown and TF-overexpression models in the gastric cancer cell lines MKN45 and AGS respectively. The gastric cancer cells were transfected with the lentivirus that downregulated TF and were divided into sh-TF#1 and sh-TF#2 groups. The control was sh-Ctrl group. The cells were transfected with the lentivirus that upregulated TF and were classified as TF group. The control was Vectorl group. Cell colony formation, cell invasion, and wound healing assays were conducted to evaluate the effects of TF on cell proliferation, invasion, and migration. Biochemical kits were used to measure intracellular lactic acid and ATP levels to assess glycolytic activity.Western blot, RT-qPCR, bioinformatics analysis, and dualluciferase reporter gene assays were performed to validate the regulatory relationship between TF and key molecules (β-catenin, TCF7L2, MMP-9, Cyclin D1) of the Wnt/β-catenin pathway. Results In the MKN45 cell line, stable transfection lines with TF gene downregulation were successfully constructed. Compared with the sh-Ctrl group, the expression levels of TF proteins and mRNA in the sh-TF#1 and sh-TF#2 groups were decreased, and the proliferation, invasion, and migration ability of the cells in the sh-TF#1 and sh-TF#2 groups were significantly weakened (P＜0.01). In the AGS cell line, stable transfectants with overexpressed TF genes were successfully constructed. Compared with the Vector group, the expression levels of TF protein and mRNA in the TF group were increased, and the proliferation, invasion, and migration ability of the cells in the TF group were significantly enhanced (P＜0.01). In MKN45 cells, compared with the sh-Ctrl group, the lactate levels in the sh-TF#1 group and the sh-TF#2 group significantly decreased, while the ATP levels significantly increased (P＜0.05). In AGS cells, compared with the Vector group, the lactate level in the TF group cells was significantly increased, while the ATP level was significantly decreased (P＜0.05). In MKN45 cells, compared with the sh-Ctrl group, the protein expression levels of CTNNB1, TCF7L2, MMP-9, and Cyclin D1 in the sh-TF#1 group and sh-TF#2 group were decreased (P＜0.01). On the contrary, in AGS cells, compared with the Vector group, the protein expression levels of β-catenin, TCF7L2, MMP-9,and Cyclin D1 in the TF group were increased (P＜0.01). However, TCF7L2, as a key transcription factor of the Wnt pathway, could directly bind to the promoter region of the TF gene and positively regulated its transcription, thereby forming a positive feedback loop that collectively drived gastric cancer progression. Conclusion TF significantly enhances the malignant behavior of gastric cancer cells by activating the Wnt/β-catenin/TCF7L2 signaling pathway and promoting glycolytic metabolism. This study reveals the critical role of the “TF-Wnt-glycolysis” axis in gastric cancer progression, providing a new theoretical basis for metabolic targeted therapy of gastric cancer.

[Key words] Tissue factor; Gastric cancer; Wnt/β-catenin signaling pathway; Metabolic reprogramming

[中图分类号] R735.2

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）06（a）-0021-08

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25100302

[基金项目] 甘肃省卫生健康行业科研计划项目（GSWS KY2021-016）。

[作者简介]

康小娟（2001.11-），女，兰州大学第二临床医学院2024级消化内科专业在读硕士研究生；研究方向：消化系肿瘤。

[通讯作者] 李海元（1989.10-），男，博士；研究方向：消化系肿瘤微创及综合治疗。

（收稿日期：2025-10-09）

（修回日期：2026-01-07）