黑色素瘤是一种恶性程度高、易转移和治疗抵抗的皮肤肿瘤，晚期患者的5年生存率不足20%[1-2]。尽管手术、靶向治疗和免疫治疗等联合治疗方案将生存率提升至50%，但肿瘤异质性和药物耐药性导致约40%的患者治疗无效[3-7]。大柴胡汤源自《伤寒论》，其“外解少阳、内泻阳明”之功与黑色素瘤“毒邪内蕴、气滞血瘀、阳明热结”的病机契合。

现代研究显示，大柴胡汤可通过多靶点调控抗炎、免疫及肿瘤微环境来发挥抗肿瘤功效[8-9]。在此基础上配伍黄芪与天花粉，既可增强原方疏肝利胆、通腑泄热之效；又能益气养阴、托毒生肌，弥补扶正不足之力，形成攻补兼施的配伍特点。现代药理学研究认为，大柴胡汤可能通过调控Bcl-2/Bax比例，激活Caspase级联反应，诱导线粒体途径的凋亡[10]。此外，黄芪中的黄芪多糖呈剂量依赖性地通过内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）增强阿霉素在肝癌细胞中诱导的凋亡[11]；天花粉中的天花粉蛋白在肺腺癌中可通过增加MICU3介导的线粒体钙内流促进肿瘤细胞死亡[12]。黑色素瘤细胞中的高频基因突变可导致蛋白稳态失衡，由此产生过度激活的ERS可通过PERK-CHOP通路诱导细胞凋亡，进一步支持上述配伍在黑色素瘤治疗中的潜在机制[13]。本研究旨在通过分子生物学技术，探讨大柴胡汤化裁方是否通过调控ERS促进黑色素瘤细胞凋亡，为其临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与药物

人恶性黑色素瘤细胞A375购自厦门逸漠生物科技有限公司[生产批号：（IMMOCELL）IM-H332）]；人正常肝细胞L-02购自中国科学院细胞库（生产批号：1101HUM-PUMC001138）。

柴胡（生产批号：20230225）、黄芩（生产批号：22042801）、大黄（生产批号：220120004）、炙枳实（生产批号：220813002）、白芍（生产批号：23021501）、姜半夏（生产批号：20221205）、生姜（生产批号：198210601）和大枣（生产批号：22111404）均购自河北橘井药业有限公司；黄芪（生产批号：22120501）和天花粉（生产批号：22071901）购自北京同仁堂药业有限公司。

1.2 仪器与试剂

超高灵敏度化学发光成像系统（型号：734BR0376）购自美国Bio-Red公司；倒置显微镜（型号：CKX53）购自日本Olympus公司；全波段酶标仪（型号：SynergyⅡ）购自美国Bio-Tek公司；共聚焦显微镜（型号：FV3000）购自日本Olympus公司。

细胞增殖及毒性检测试剂盒（货号：MA0218-2）购自美仑云（北京）细胞生物科技有限公司；结晶紫染色液（货号：G1063）和0.1% DAPI溶液（货号：C0065）购自北京索莱宝科技有限公司；细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（货号：C1052）、钙含量显色检测试剂盒（货号：S1063S）购自上海碧云天生物技术股份有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）测定试剂盒（货号：E004-1-1）购自南京建成生物工程研究所；Caspase 3抗体（货号：19677-1-AP）、p53抗体（货号：10442-1-AP）、Bcl-2抗体（货号：12789-1-AP）、Bax抗体（货号：50599-2-Ig）、β-actin抗体（货号：HRP-66009）均购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.3 大柴胡汤化裁方水煎液的制备

将柴胡24 g、黄芩9 g、大黄6 g、炙枳实12 g、白芍9 g、姜半夏12 g、生姜15 g、大枣12 g、黄芪15 g和天花粉9 g常规中药煎煮法煎煮1 h，复煎30 min后将两次药液混合浓缩至浓度为2 g/ml[14-15]。药液经1 000 r/min离心20 min（离心半径10 cm），取上清液，4 ℃保存。

1.4 CCK8法检测细胞增殖情况

取对数生长期A375和L-02细胞，以8 000个/孔接种于96孔板，37 ℃、5% CO2培养过夜。A375细胞分别加入含梯度浓度大柴胡汤化裁方药液（0、0.01、0.06、0.25、1.00、4.00、16.00、64.00 mg/ml）的10% FBS培养基，对照组仅加完全培养基，每组重复6次[14]；48 h后加入CCK8溶液，37 ℃孵育1 h，测定450 nm波长处吸光度并计算IC0、IC25、IC50值。随后以3种浓度分别处理2种细胞，分组为低剂量组、中剂量组、高剂量组，同法检测吸光度。

1.5 平板克隆形成实验检测细胞增殖能力

将对数生长期细胞以2 000个/孔接种于6孔板中，37 ℃、5% CO2培养过夜后，以3种浓度分别处理A375细胞，每48小时换液1次，持续培养15 d。多聚甲醛固定20 min后，0.5%结晶紫染色15 min，ddH2O洗涤，干燥后拍照。每组重复3次。

1.6 流式细胞仪检测细胞周期与凋亡

A375细胞种板后以3种浓度分别处理，培养48 h后收集细胞，70%乙醇4 ℃固定过夜，PBS洗涤，按试剂盒说明染色，流式细胞仪检测。每组重复3次。

1.7 形态学凋亡检测

将A375细胞以每孔1.5×105个的密度接种于6孔板中，37 ℃、5% CO2培养过夜后，加入3种浓度药液的培养基处理细胞48 h，多聚甲醛固定20 min后，用0.1% DAPI溶液对固定后的细胞染色10 min，PBS洗涤3次，使用荧光显微镜观察细胞。每组重复3次。

1.8 Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达

A375细胞以4×105/孔接种于6孔板，37 ℃、5% CO2培养过夜后，以3种浓度处理48 h。RIPA裂解液提取蛋白，BCA定量后经10% SDS-PAGE分离，转至PVDF膜。5%脱脂奶封闭后，依次加入Caspase 3、Bcl-2、Bax、p53及β-actin一抗（1∶2 000，4 ℃孵育过夜）和二抗（室温孵育1 h），ECL显影后Image J分析条带灰度值。每组重复3次。

1.9 ROS、钙含量测定

取对数生长期的A375细胞，调整至4×105个/孔接种至6孔板，细胞贴壁后，按照分组加入对应药物，每组重复3次，作用48 h后与DCFH-DA探针37 ℃避光孵育，PBS洗涤，在激发波长485 nm和发射波长435 nm下检测荧光强度，荧光显微镜拍照分析ROS含量。

细胞裂解液冰浴超声破碎，1 000 r/min离心10 min（离心半径为10 cm），上清液与钙显色液（1∶5）37 ℃避光孵育；不同浓度标准品（0、0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0 mmol/L）同步处理，双波长（650/800 nm）测定ΔA值，按公式计算钙含量（mmol/106 cells）。钙含量（mmol/106 cells）=（ΔA样本-ΔA空白）/（ΔA标准-ΔA空白）×标准品浓度×稀释倍数÷细胞数（×106）。

1.10 RT-qPCR法检测相关基因表达

A375细胞（4×105/孔）经IC50药液处理48 h后，按试剂盒步骤提取RNA后逆转录为cDNA。qPCR采用SYBR Green法扩增，每组重复3次。在冰上配制20 µl反转录反应体系，包含1 µg RNA模板、4 µl All-in-One MasterMix GIV、1 µl dsDNase，并用无核酸酶水补足至总体积；反应程序为50 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 s使酶失活，4 ℃保持，所得cDNA用于后续qPCR检测。采用SYBR Green法进行RT-qPCR检测，反应体系总体积为20 µl，包含10 µl 2×SuperStar Universal SYBR Master Mix、0.4 µl 正向引物（10 µmol/L）、0.4 µl反向引物（10 µmol/L）、2 µl cDNA模板，ddH2O补足至20 µl；扩增程序为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5~15 s，60 ℃退火/延伸10~30 s，共40~45个循环，熔解曲线分析程序为95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 1 s。目标基因表达量经内参基因校正后，采用2-ΔΔCt法计算，其中ΔΔCt=（Ct实验组目标基因-Ct内参基因）-（Ct对照组目标基因-Ct内参基因）。引物列表见表1。

表1 引物序列

基因名称引物序列（5’→3’）引物长度（bp）PERK正向引物：GTCCCAAGGCTTTGGAATCTGTC23反向引物：CCTACCAAGACAGGAGTTCTGG22 EIF2S1正向引物：GCCTTTCTGTCCTCAGTCAAGC22反向引物：CTCTCCATCTGCCTCGCAAGTT22 ATF4正向引物：TTCTCCAGCGACAAGGCTAAGG22反向引物：CTCCAACATCCAATCTGTCCCG22 DDIT3正向引物：GGTATGAGGACCTGCAAGAGGT22反向引物：CTTGTGACCTCTGCTGGTTCTG22 HSP90AA1正向引物：TGAACTGGCGGAAGATAA17反向引物：CAGAGGCAGATGTGTAGT18 MAPK1正向引物：TACACCAACCTCTCGTACATCG22反向引物：CATGTCTGAAGCGCAGTAAGATT23 ACTB正向引物：CATGTACGTTGCTATCCAGGC21反向引物：CTCCTTAATGTCACGCACGAT21

1.11 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0统计学软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大柴胡汤化裁方对细胞增殖的影响

CCK8实验结果显示，当大柴胡汤化裁方浓度 ≥4.00 mg/ml时，其对A375细胞活力的抑制率呈显著性差异（P＜0.01）。基于剂量-效应曲线计算，大柴胡汤化裁方对A375细胞的IC50值为19.91 mg/ml，IC25和IC0分别为13.30、0.65 mg/ml。与对照组比较，中、高剂量组A375细胞活力降低（P＜0.01）；高剂量组L-02细胞活力降低（P＜0.01）。平板克隆实验结果显示，与对照组比较，低、中、高剂量组细胞克隆数量减少（P＜0.01）。见图1。

图1 大柴胡汤化裁方对细胞增殖的影响

2.2 大柴胡汤化裁方对细胞周期与凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，与对照组比较，中剂量组中S期与G2/M期出现阻滞，高剂量组Sub G1凋亡峰显著升高（P＜0.01）。与对照组比较，中、高剂量组细胞凋亡率升高（P＜0.01）。免疫荧光结果显示，药物处理48 h的A375细胞出现典型的凋亡形态学特征，包括核染色质边缘化、核浓缩及新月体形成。Western blot法检测结果显示，与对照组比较，中剂量组p53、Bax蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低（P＜0.05或P＜0.01）；高剂量组p53、Bax蛋白表达升高（P＜0.01）。见图2。

图2 大柴胡汤化裁方对细胞周期与凋亡的影响（n=3）

2.3 大柴胡汤化裁方对HSP90AA1靶点及PERK-eIF2α-ATF4通路的影响

与对照组比较，低、中、高剂量组HSP90AA1、MAPK1 mRNA表达降低，PERK、EIF2S1、ATF4 mRNA表达升高（P＜0.05或P＜0.01）；中、高剂量组DDIT3 mRNA表达升高（P＜0.01）。见图3。

图3 大柴胡汤化裁方对HSP90AA1靶点及PERK-eIF2α-ATF4通路的影响（n=3）

2.4 大柴胡汤化裁方对钙含量及ROS含量的影响

大柴胡汤化裁方各剂量组处理后A375细胞的绿色荧光强度较对照组增强，以高剂量组最为显著。与对照组比较，低、中、高剂量组钙、ROS含量升高（P＜0.01）。见图4。

图4 大柴胡汤化裁方对ROS含量及钙含量的影响（n=3）

3 讨论

ERS在肿瘤发生、发展中具有双重作用，具体表现为适度地激活可通过未折叠蛋白反应维持细胞稳态，而持续应激则会导致错误折叠蛋白累积，进而触发凋亡[16]。同时，这一过程可诱发Ca2+失衡及氧化应激等，进一步加剧凋亡的发生[17]。目前，针对ERS的抗肿瘤药物整体处于探索和发展阶段，虽然蛋白酶体抑制剂如硼替佐米已用于多发性骨髓瘤等癌症治疗，但较大的不良反应限制其广泛应用，且不同癌症对ERS的敏感性差异大，这可能是由于不同癌症对ERS“适度”发生与“过度”发生的界定值差异所致[16-19]。开发特异性更强及不良反应更小的靶向药物是临床亟须解决的问题。

本研究结果显示，大柴胡汤化裁方可通过促进A375细胞凋亡抑制黑色素瘤进展。大柴胡汤化裁方的有效成分均具有明确的药理活性，如黄酮类成分可通过激活内质网应激相关的未折叠蛋白反应，上调促凋亡因子CHOP和ATF4，从而诱导肿瘤细胞凋亡[20-22]；酚酸类成分可通过ROS生成激活MAPK和ERS通路导致结肠癌细胞凋亡[23]；生物碱类成分可通过上调促凋亡蛋白p53表达，抑制PI3K/Akt信号通路，从而达到抑制肿瘤增殖的作用[24]。多组分协同作用于内质网应激和死亡受体通路，可能构成大柴胡汤化裁方促进肿瘤细胞凋亡的核心机制。

研究显示，HSP90AA1与MAPK1是引起凋亡的潜在作用蛋白[23]。HSP90AA1作为热休克蛋白90家族的核心成员，是一种高度保守的分子伴侣，通过ATP依赖的机制参与客户蛋白的正确折叠和功能维持。在肿瘤发生、发展中，HSP90AA1通过调控MAPK家族成员如MAPK1、MAPK3、MAPK9等的构象稳定和功能活化，促进细胞周期进展并抑制凋亡[24-27]。Hu等[28]使用抑制剂阻断HSP90α功能后，细胞凋亡水平上升的同时自噬水平下降，提示HSP90AA1可能通过调节未折叠蛋白反应的平衡来影响细胞的存活与死亡。本研究结果显示，大柴胡汤化裁方抑制A375细胞中HSP90AA1与MAPK1的表达，并可通过提高Caspase 3、p53、Bax及降低Bcl-2表达，诱导细胞凋亡。HSP90AA1作为分子伴侣蛋白，与蛋白质正确折叠有关，而蛋白错误折叠增多促使细胞中内质网应激增加，导致PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路受到影响，CHOP通过抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、促进促凋亡蛋白Bax的表达，激活线粒体凋亡途径，进而激活Caspase 3，最终引起细胞凋亡的发生[13,29-30]。据此，推测大柴胡汤化裁方可能通过PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路抑制黑色素瘤细胞增殖。

4 小结

大柴胡汤化裁方能够在基因水平上影响HSP90AA1-MAPK1的相互作用进而促进PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路调控内质网应激的发生，最终导致细胞内钙含量升高，p53、Caspase 3和Bax等促凋亡蛋白增加导致细胞凋亡的发生。大柴胡汤化裁方具有加剧黑色素瘤细胞内质网应激的能力，是一种潜在的抗黑色素瘤的天然药物。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Exploration of the effect of modified Dachaihu Decoction on the proliferation of melanoma cells based on the endoplasmic reticulum stressapoptosis pathway

MO Zhixin1* YU Hanning1* WANG Mengyu1 WANG Xiaohui2 HU Jingyan3 LIU Wenqing3 HU Xiuhua1

1.School of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China; 2.Modern Research Center of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China; 3.School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

[Abstract] Objective To explore the effect and mechanisms of modified Dachaihu Decoction on the proliferation of melanoma. Methods Human malignant melanoma cell A375 and human normal liver cell L-02 were cultured in vitro.A375 cells in the logarithmic growth phase were added to 10% FBS medium containing gradient concentrations of modified Dachaihu Decoction (0.01, 0.06, 0.25, 1.00, 4.00, 16.00 mg/ml, and 64.00 mg/ml), and the IC0, IC25, and IC50 values of it on A375 cells were calculated. Based on this concentration, the cells were divided into high-dose, mediumdose, and low-dose groups. The effect of modified Dachaihu Decoction on cell proliferation was detected by clone formation assay; flow cytometry was used to detect the effects on cell cycle and apoptosis; the effect on the expression of apoptotic proteins (Caspase 3, p53, Bax, and Bcl-2) were detected by Western blot; the effect on the expressions of HSP90AA1, MAPK1, PERK, EIF2S1,ATF4, and DDIT3 mRNA were detected by qRT-PCR; and the effects on reactive oxygen species (ROS) and calcium content were detected by chemical fluorescence and spectrophotometry. Results The IC50 value of modified Dachaihu Decoction for A375 cells was 19.91 mg/ml, and the IC25 and IC0 values were 13.30 mg/ml and 0.65 mg/ml,respectively. Compared with the control group, the number of cell clones in the low-dose, medium-dose, and high-dose groups decreased (P＜0.01). Compared with the control group, the apoptosis rate of cells in the medium-dose and highdose groups increased (P＜0.01). Compared with the control group, the expressions of p53 and Bax protein in the medium-dose group increased, while the expression of Bcl-2 protein decreased (P＜0.05 or P＜0.01); the expressions of p53 and Bax protein in the high-dose group increased (P＜0.01). Compared with the control group, the expressions of HSP90AA1 and MAPK1 mRNA in the low-dose, medium-dose, and high-dose groups decreased, while the expressions of PERK, EIF2S1, and ATF4 mRNA increased (P＜0.05 or P＜0.01); the expression of DDIT3 mRNA increased in the medium-dose and high-dose groups (P＜0.01). Compared with the control group, the calcium and ROS contents in the low-dose, medium-dose, and high-dose groups increased (P＜0.01). Conclusion The modified Dachaihu Decoction may affect the gene expression levels of key factors in the PERK-eIF2α-ATF4 pathway by reducing the expression of the HSP90AA1 gene, and induce oxidative damage and calcium overload, thereby promoting cell apoptosis and inhibiting cell proliferation.

[Key words] HSP90AA1; Melanoma; Endoplasmic reticulum stress; Apoptosis; Modified Dachaihu Decoction

[中图分类号] R739.5；R285.5

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）06（a）-0029-08

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25090983

[基金项目] 精准经方标准创新与精准化开发研究项目（2020110031000381）。

[作者简介]

莫芷欣（1999.10-），女，硕士；研究方向：中药抗肿瘤。于涵宁（2000.10-），女，北京中医药大学生命科学学院中西医结合基础专业在读硕士研究生；研究方向：中药抗肿瘤。

*具有同等贡献

[通讯作者] 胡秀华（1975.5-），女，博士，副教授，硕士生导师；研究方向：中西医结合抗肿瘤。

（收稿日期：2025-09-12）

（修回日期：2026-01-21）