滋养细胞功能缺陷在妊娠相关疾病中的作用已获公认，但其深层机制尚不明确。研究发现，维生素D代谢异常是子痫前期、胎儿生长受限和早产的重要风险因素，其活性形式可通过维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）调控滋养细胞等功能[1-4]。Wnt/β-catenin通路是调控胚胎发育与细胞迁移的关键途径，其异常与多种妊娠疾病相关[5-6]。值得注意的是，VDR本身可直接激活Wnt/β-catenin通路[7-8]。然而，维生素D-VDR系统是否及如何通过该通路影响滋养细胞的侵袭能力，目前仍不清楚。为探究维生素D-VDR系统在滋养层细胞侵袭与迁移中的作用机制，本研究采用维生素D类似物阿法骨化醇进行体外干预。维生素D在体内需经肝、肾代谢转化为活性形式1，25-二羟基维生素D，进而通过VDR发挥作用。阿法骨化醇作为活性前体，已在体外完成1α-羟化，进入体内仅需一步活化即可转化为活性维生素D3，不依赖肾脏1α-羟化酶[9-10]。体外培养的滋养层细胞自身活化维生素D的能力有限，使用阿法骨化醇可绕过该限速步骤，更直接、可靠地激活VDR，从而精准研究其下游信号与细胞功能[11]。本研究通过阿法骨化醇激活VDR，旨在探讨维生素D-VDR系统是否通过调节Wnt/β-catenin信号增强滋养层细胞侵袭能力，为妊娠相关疾病的机制与防治提供新见解。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞来源 本研究采用人绒毛膜外滋养层细胞系HTR8/SVneo，来源于武汉普诺赛生命科技有限公司，由武汉华联科生物技术有限公司实验室保种。该细胞系源于人早期妊娠（第一孕期）的绒毛组织，经过SV40大T抗原永生化处理建立[12]。HTR8/SVneo细胞保留了原代滋养层细胞的许多关键特性，如侵袭、增殖和管状形成能力，因此被广泛用作研究人类胎盘发育、母胎界面重塑及妊娠相关疾病的体外模型[13]。

1.1.2 主要试剂与仪器 阿法骨化醇（货号：A120129）购自中国阿拉丁公司；RPMI 1640培养基（货号：SH30809.01B）购自美国Hyclone公司；胎牛血清（货号：P1010）购自美国Gibco公司；PBS（货号：P1010）、0.25%胰蛋白酶（货号：T1350）、CCK8（货号：CA1210）、十二烷基硫酸钠（SDS）（货号：S8010）、RIPA（强）组织细胞快速裂解液（货号：R0010）均购自中国索莱宝科技有限公司；Trizol试剂（货号：15596026）购自美国Ambion公司；兔VDR（货号：PAB33265）、兔β-catenin（货号：PAB30837）、兔E-cadherin（货号：PAB33542）、兔GAPDH（货号：PAB36269）及山羊抗兔 IgG（货号：SAB43714）均购自中国bioswamp公司；Transwell小室（货号：3422）购自美国Corning公司；化学发光试剂（货号：WBKLS0500）及聚偏氟乙烯膜（货号：IPVH00010）购自美国millipore公司；Matrigel（货号：354230）购自美国BD公司；4%甲醛（货号：10010018）购自中国国药集团化学试剂有限公司；PrimeScript Ⅱ RTase（货号：2690A）购自日本TaKaRa公司；SYBR FAST qPCR Master Mix（货号：KM4101）购自美国KAPA Biosystems公司。

超净工作台（批号：SW-CJ-1D）购自中国苏州智净净化设备有限公司；酶联免疫检测仪（批号：AMR-100）购自中国奥盛公司；倒置荧光显微镜（批号：DMIL LED）购自德国Leica公司；荧光定量PCR仪（批号：CFX-Connect 96）购自美国Bio-Rad公司；全自动化学发光分析仪（批号：Tanon-5200）购自上海天能公司。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养 将HTR8/SVneo细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，于37 ℃、5%CO2条件下培养。倒置显微镜观察其形态以决定传代时机。PBS（2 ml）洗涤去除旧培养基，加入0.25%胰酶（1 ml），37 ℃消化。镜下观察到细胞变圆时立即翻转培养瓶终止消化，弃胰酶。加入完全培养基（1 ml）润洗细胞后弃去。加入完全培养基（2 ml），轻柔吹打使细胞脱壁分散。补加完全培养基至10 ml总量，制成悬液，分装至两个新培养瓶（1∶2比例），再放回培养箱。

1.2.2 实验分组 既往研究显示，活性维生素D调节滋养层细胞功能的有效浓度多在10～100 nmol/L范围内[14]。为系统探究其剂量依赖效应，本研究设置20 nmol/L和40 nmol/L两个中低浓度以覆盖生理/药理调节范围，并增设160 nmol/L高浓度组以评估更高剂量的效应及潜在影响。故本研究设置0 nmol/L（对照组）及20、40 nmol/L和160 nmol/L 4个浓度组，并予以相应阿法骨化醇浓度处理HTR8/SVneo细胞，同时分别于0、12、24、48、72、96 h时间点收集样本。根据后续实验中HTR8/SVneo细胞VDR蛋白的基础表达水平及侵袭能力，在检测β-catenin与E-cadherin表达实验中，将其划分为VDR高表达组（40 nmol/L阿法骨化醇）与VDR低表达组（0 nmol/L阿法骨化醇）。

1.2.3 HTR8/SVneo细胞增殖实验 采用CCK8实验检测细胞增殖能力。按照0 nmol/L（对照组）及20、40 nmol/L和160 nmol/L的阿法骨化醇处理细胞，分于96孔板，3×103个细胞/孔，3孔/组，每孔100 μl，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养过夜，继续培养0、12、24、48、72、96 h。然后，加入CCK8溶液，继续培养4 h。采用酶联免疫检测仪检测450 nm波长处的光密度（optical density，OD）值，OD450值升高代表药物处理后活细胞数量增多。

1.2.4 RT-qPCR法 总RNA使用Trizol试剂提取，按照0 nmol/L（对照组）及20、40、160 nmol/L 4个浓度组进行实验，使用PrimeScript Ⅱ RTase合成cDNA。PCR反应体系中加入荧光物质，采用SYBR FAST qPCR Master Mix进行检测，反转录反应体系（20 μl）包含总RNA 500 ng、5×PrimeScript Ⅱ Buffer 4 μl、10 mmol/L dNTP Mix 2 μl、Oligo DT18 primer 1 μl、RNase Inhibitor（40 U/μl） 1 μl、PrimeScript Ⅱ RTase （200 U/μl） 1 μl、ddH2O补至20 μl；扩增体系（20 μl）包含SYBR FAST qPCR Master Mix 10 μl、正向引物（10 μmol/L） 0.5 μl、反向引物（10 μmol/L）0.5 μl、cDNA模板 1 μl、ddH2O 8 μl。每组重复2次实验，所用PCR引物序列如下：VDR正向引物为5’-GACGCCCACCATAAGACC-3’；VDR反向引物为5’-CTCCCTCCACCATCATTCA-3’；GAPDH正向引物为5’-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3’；GAPDH反向引物为5’-GAGTGGGTGTCGCTG TTGA-3’。以GAPDH作为内参基因，qPCR在荧光定量PCR仪上进行。扩增程序如下：95 ℃预变性3 min；随后进行40个循环（95.0 ℃变性5 s，56.0 ℃退火10 s，72.0 ℃延伸25 s）；最后进行熔解曲线分析（65.0 ℃起始，每5秒升温0.5 ℃至95.0 ℃）。采用2-ΔΔCt法分析基因表达量。

1.2.5 Western blot法 按每20 mg组织加入200 μl裂解液的比例加入裂解液（裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂）提取蛋白质，每组重复2次实验。裂解产物经过SDS-PAGE，转移到聚偏氟乙烯膜上，并在5%的牛奶中阻断。0 nmol/L（对照组）及20、40、160 nmol/L 4个浓度组为同一批进行实验，其中一抗为兔VDR、兔GAPDH，稀释比为1∶1 000，二抗为山羊抗兔IgG，稀释比为1∶10 000。VDR高表达组（40 nmol/L阿法骨化醇）与VDR低表达组（0 nmol/L阿法骨化醇）为同一批进行实验，其中一抗为兔VDR、兔β-catenin、兔E-cadherin、兔GAPDH，稀释比为1∶1 000，二抗为山羊抗兔IgG，稀释比为1∶10 000，使用ECL化学发光检测及TANON GIS软件，以GAPDH为对照，读取相关条带灰度值。

1.2.6 细胞侵袭实验 为评估VDR高表达状态对侵袭能力的影响，同时观察更长时间点的效应，本研究根据CCK8增殖实验及前期VDR表达结果，选用 0 nmol/L（对照组）及40、160 nmol/L 3个浓度组，分别处理细胞72 h 和 96 h 后进行 Transwell 侵袭实验。使用Matrigel对腔室进行预处理。将Transwell小室用PBS预湿5 min，铺Matrigel胶（80 μl/室），37 ℃固化30 min。将细胞（1×105/孔）接种于12孔板进行预处理，3孔/组，24 h后按照分组换入含有0、40、160 nmol/L的阿法骨化醇及2%胎牛血清培养基处理细胞0、24、48、72、96 h。消化各组细胞，重悬于含1%胎牛血清的培养基（密度1×105/ml），接种500 μl至小室上腔；下腔加入750 μl含10%胎牛血清的培养基，培养24 h。弃培养基，PBS清洗；4%甲醛固定20 min，0.5%结晶紫染色30 min；PBS漂洗3次，晾干。棉签擦除小室内未迁移细胞，显微镜下随机视野计数迁移细胞。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 10统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用双因素方差分析，组内多重比较采用Tukey事后检验。对于不满足方差分析条件的数据，采用Kruskal-Wallis H检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度阿法骨化醇对HTR8/Svneo细胞增殖的影响

用RPMI-1640培养基对细胞进行复苏，复苏后细胞生长状态良好，满足后续实验要求。采用CCK8实验检测细胞增殖能力，结果显示不同时间点不同浓度阿法骨化醇刺激下HTR8/SVneo细胞的增殖情况与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（图1），72 h后细胞生长均进入平台期。

图1 不同浓度阿法骨化醇刺激下HTR8/SVneo细胞生长情况

2.2 不同浓度阿法骨化醇对HTR8/Svneo细胞VDR表 达的影响

RT-qPCR检测结果显示，阿法骨化醇处理可使VDR mRNA表达量呈上升趋势。72 h 时，40 nmol/L和160 nmol/L浓度组达到VDR mRNA表达峰值（图2）。Western blot法检测结果显示，VDR蛋白表达水平随阿法骨化醇处理时间的延长而呈现变化趋势，在培养72 h时，40 nmol/L浓度组的VDR蛋白表达水平均达到最高水平，而160 nmol/L浓度组也接近最高水平。如图3所示，24 h时各浓度组VDR蛋白表达水平均低于基线（0 h）水平，平均为0 h的（0.57 ± 0.10）倍。部分结果仅为趋势描述，未进行组间统计学比较。综合上述表达变化，阿法骨化醇对VDR的调控呈现明显的时相特征：早期（24 h）表达抑制，中期（48～72 h）表达激活（72 h达观察期内最高水平或接近最高水平），后期（96 h）表达回落。

图2 不同阿法骨化醇对HTR8/Svneo细胞的VDR mRNA表达量的影响

图3 不同浓度阿法骨化醇处理对HTR8/Svneo细胞VDR蛋白表达水平的影响

2.3 VDR高表达状态对Wnt/β-catenin通路的影响

根据前期VDR表达结果，40 nmol/L浓度下VDR表达在较高水平（图2、3），因此选用40 nmol/L阿法骨化醇处理作为VDR高表达组，0 nmol/L阿法骨化醇处理作为VDR低表达组。Western blot法检测结果显示，VDR低表达组与VDR高表达组β-catenin、E-cadherin蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4。

图4 β-catenin与E-cadherin蛋白表达水平比较

2.4 VDR高表达状态对HTR8/Svneo细胞侵袭能力的影响

鉴于VDR表达趋势72 h呈现较高水平（图2、3），且细胞增殖于72 h后进入平台期（图1），本研究选择72 h作为评估阿法骨化醇促迁移效应的主要观察时间点，并同时观察96 h以评估效应的持久性。随着培养时间延长，Transwell上层的非迁移细胞数量逐渐减少，提示细胞持续迁移。培养72 h后，40 nmol/L和160 nmol/L浓度组剩余的非迁移细胞数量均少于对照组（P＜0.05）；培养96 h后，各组间剩余的非迁移细胞数量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。40 nmol/L和160 nmol/L浓度组间剩余的非迁移细胞数量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（图5）。

图5 不同浓度阿法骨化醇处理对HTR8/Svneo细胞侵袭能力的影响

3 讨论

3.1 阿法骨化醇对HTR8/SVneo细胞的增殖活性无显著作用

既往研究显示，滋养细胞增殖能力下调可能是妊娠相关疾病，例如子痫前期发病机制中的一个重要因素[15]。此外，研究还发现，在非缺氧/再氧培养条件下，浓度在100 nmol/L以内的1，25（OH）2D3不会促进滋养细胞增殖[16]。本研究使用的前体药物阿法骨化醇同样未观察到促增殖效应，提示维生素D类物质在非应激条件下对滋养细胞增殖可能具有中性作用。另外，本研究进一步观察到，即使浓度提升至160 nmol/L，对HTR8/Svneo细胞仍然未表现出增殖抑制作用。先前研究确定100 nmol/L及以下浓度无促增殖作用[16]。本研究将观察范围扩展至160 nmol/L，仍然未观察到抑制作用。这提示阿法骨化醇在相对较宽的浓度范围内对滋养细胞增殖呈现中性效应，可能不是通过直接调控滋养细胞增殖来实现可能存在的保护作用，而是通过其他途径，例如调节侵袭、迁移作用等。

3.2 阿法骨化醇促进VDR生成呈现早期抑制、中期激活、后期回落独特时相模式

妊娠期维生素D状态低也可能增加不良围生期结局的风险，包括妊娠高血压、胎儿生长受限和早产等妊娠疾病[3]；然而，尽管流行病学关联和干预效果研究支持其作用，但其具体分子与生理机制仍是亟待解决的关键问题。

既往研究揭示，肾近端小管细胞、肠道上皮细胞等本身表达25-羟化酶，那么外源性加入的阿法骨化醇可在细胞内转化为骨化三醇，进而与VDR结合并发挥作用[17-18]。当活性形式的骨化三醇与VDR结合后，会激活VDR介导的信号通路。这一通路不仅会调控下游靶基因，还会通过正反馈机制上调VDR自身的表达。因此，若阿法骨化醇在细胞内成功转化为骨化三醇，激活VDR后，就可能会启动正反馈，最终表现为“阿法骨化醇处理”与“VDR表达上调”的正相关性。本研究进一步观察到阿法骨化醇在VDR相关实验中的独特价值，为相关机制探索提供更可靠的实验工具。后续可进一步拓展其在组织特异性VDR研究、新型疾病模型中的应用，为维生素D相关领域研究提供更多实际应用技术支撑。

临床研究发现PE患者的动脉、静脉及关键器官胎盘中的VDR蛋白表达均低于健康孕妇，同时患者母体循环中的维生素D水平也降低，且该水平与血管组织中VDR的表达量呈显著正相关[4,19]。这些密切的临床关联可推测，母体维生素D状态低下可能是导致PE胎盘组织VDR表达下调的关键上游驱动因素。这一因果关系在体外实验中获得了证据支持，在胎盘血管平滑肌细胞中，活性维生素D处理可显著诱导VDR蛋白表达[20]。本研究在HTR8/SVneo中也进一步观察到，补充阿法骨化醇处理后VDR表达呈现一定的动态变化趋势。

本实验观察VDR蛋白表达随时间的变化，以确定后续功能实验的最佳处理时间。然而，本研究显示阿法骨化醇对VDR自身的转录调控并非简单的线性激活，而是一个复杂且动态的自限性反馈过程，呈现出早期抑制、中期激活、后期回落的独特时相模式。早期抑制现象可能是VDR信号通路的一种自我调节机制，旨在防止过度激活。潜在机制可能涉及抑制性因子/共抑制因子的快速诱导、受体降解通路的短暂激活或染色质结构的瞬时抑制性改变，有待今后深入研究。克服早期抑制后，在中期（48～72 h），阿法骨化醇-VDR复合物可能有效结合VDR基因自身的调控区域促进转录。本研究还观察到，VDR表达在72 h达到诱导峰值，其中40 nmol/L和160 nmol/L浓度效果最佳。峰值后的下降趋势体现了典型的负反馈调节，高水平VDR或其激活的下游产物可能反过来抑制自身转录，确保信号强度受控。这种精细的时空调控模式在HTR8/Svneo中被揭示，凸显了在研究维生素D信号通路时，时间因素与剂量因素具有同等重要性。本研究关于VDR表达时相特征的结论主要基于对表达趋势的观察描述，未进行组间统计学比较，因此应视为探索性发现。后续研究需采用规范的统计分析方法验证这一动态模式。

3.3 阿法骨化醇-VDR系统可调控Wnt信号通路影响滋养细胞上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）

Wnt蛋白家族是一类关键的分泌型糖蛋白，在机体发育和组织稳态调控中发挥核心作用，主要通过调控细胞增殖、迁移、分化和凋亡来实现其生物学功能[6]。Wnt/β-catenin通路在调控滋养细胞侵袭中发挥核心作用。系列研究证实，瘦素可通过促进β-catenin核转位以增强HTR-8/SVneo细胞的侵袭能力；而在此过程中，若敲低β-catenin，则瘦素的促侵袭效应被显著抑制，提示β-catenin是瘦素下游的关键效应分子[21]。反之，当该通路受到抑制时（如使用Wnt5a或受人巨细胞病毒感染），β-catenin的表达与活性下降，HTR-8/SVneo细胞侵袭能力也随之减弱[22-23]。更重要的是，在人巨细胞病毒感染的模型中，通路激活剂LiCl可成功逆转侵袭抑制表型[23]。这一“功能恢复”实验最终证实，Wnt/β-catenin通路的活性是直接调控HTR-8/SVneo细胞侵袭行为的决定性因素。

鉴于维生素D显著促进HTR8/Svneo细胞迁移，且已知VDR可调控Wnt通路[7-8]；本研究探究其是否通过VDR/Wnt/β-catenin信号通路介导促迁移效应。本研究观察到，在VDR高表达组中，EMT关键标志物β-catenin的表达呈上升趋势，但未达到统计学显著性，因此该变化应视为一种趋势而非确定性结论。这与经典的促迁移/EMT表型方向一致，提示VDR表达增加可能倾向于激活Wnt/β-catenin信号通路，从而潜在促进滋养细胞的迁移和侵袭。然而，一个值得注意的发现是，与VDR低表达组比较，VDR高表达组中E-cadherin的表达呈现上调趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），这与通常认为E-cadherin下调促进迁移的经典EMT模型不相符[24-25]。这一发现虽然支持了本研究中观察到的维生素D促迁移效应，但也凸显了其调控机制的复杂性及独特性。原因可能在于HTR8/Svneo细胞本身进行的是非经典的、受严格调控的侵袭性迁移。此外，VDR信号可能以一种特殊方式协调细胞黏附和迁移动力学，可能在维持或上调某些黏附蛋白（如E-cadherin）的同时，通过其他机制促进迁移。未来研究需要检测更多EMT标志物（如N-cadherin、Vimentin、Snail等）及侵袭相关分子，以更全面地阐明VDR信号在滋养细胞迁移中的具体作用模式。

3.4 阿法骨化醇在40 nmol/L浓度下饱和促进HTR8/Svneo细胞迁移

维生素D缺乏会降低其受体VDR的表达，削弱VDR在胎盘血管中维持稳态、抗炎和免疫调节的关键保护作用，这可能促进子痫前期、胎儿生长受限和早产等的血管病变并最终引发疾病。既往研究发现，在细胞水平维生素D浓度升高可上调VDR表达[26]。临床研究显示，补充维生素D可剂量依赖性地降低PE风险，例如，2 000 IU有效，4 000 IU效果更强[27]。

在本研究的Transwell迁移实验中，添加40 nmol/L和160 nmol/L阿法骨化醇刺激后，HTR8/Svneo细胞迁移穿膜的数量显著增加，但40 nmol/L浓度即可达到最大促迁移效果，这提示40 nmol/L是本实验条件下实现最大效应的最低有效浓度。另外，培养96 h后，各组Transwell小室内剩余的未迁移细胞数量比较，差异无统计学意义。这侧面提示40 nmol/L及160 nmol/L细胞在实验过程中迁移得更快、更早，导致在96 h这个终点时，各组剩下的无法迁移或迁移慢的细胞数量趋于一致。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Regulatory effect of the VDR/Wnt signaling pathway activated by alfacalcidol on the invasion and migration of trophoblast cells

YANG Yan1 WANG Yang2 Adila Sulidan3 SUI Shuang3▲

1.Graduate School, Xinjiang Medical University, Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830011, China; 2.Department of Pharmacy, the Third People's Hospital of Yibin, Sichuan Province, Yibin 644000, China; 3.Department of Obstetrics and Gynecology, People's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830011, China

[Abstract] Objective To investigate the molecular mechanism by which alfacalcidol (a vitamin D analogue) regulates the Wnt/β-catenin signaling pathway via the vitamin D receptor (VDR) and thereby affects epithelial-mesenchymal transition in trophoblast cells. Methods Using the human trophoblast cell line HTR8/SVneo as a model, cells were treated with different concentrations of alfacalcidol (0, 20, 40 nmol/L, and 160 nmol/L). Based on basal VDR protein expression and invasive capacity of HTR8/SVneo cells in subsequent experiments, cells were divided into a VDR highexpression group (40 nmol/L alfacalcidol) and a VDR low-expression group (0 nmol/L alfacalcidol) for the detection ofβ-catenin and E-cadherin expression. Cell proliferation, expression of key molecules, and migratory ability were analyzed using CCK8 proliferation assay, RT-qPCR, Western blot, and Transwell invasion assay. Results Alfacalcidol(0-160 nmol/L) was found to have no significant effect on cell proliferation. In HTR8/SVneo cells, the regulation of VDR by alfacalcidol exhibited distinct temporal characteristics: early (24 hours) inhibition, mid-term (48-72 hours)activation, and late-stage (96 hours) decline. At 72 hours, the expression levels of VDR mRNA and protein in the 40 nmol/L concentration group and the 160 nmol/L concentration group were relatively higher. There was no statistically significant difference in the protein expression levels of β-catenin and E-cadherin between the VDR low-expression group and the VDR high-expression group (P＞0.05). After 72 hours of cultivation, the number of remaining non-migrating cells in the 40 nmol/L and 160 nmol/L concentration groups was lower than that in the control group (P＜0.05); after 96 hours of cultivation, there was no statistically significant difference in the number of remaining non-migrating cells among the groups (P＞0.05). Conclusion Alfacalcidol enhances trophoblast cell epithelial-mesenchymal transition by inducing VDR expression and activating the Wnt/β-catenin pathway. However, the aberrant upregulation of E-cadherin suggests a possible unique regulatory mechanism of trophoblast migration. This study provides a new molecular basis for the vitamin D-VDR system in improving pregnancy-related diseases and highlights the critical role of time-dose effects in VDR signaling regulation.

[Key words] Vitamin D; Vitamin D receptor; Wnt signaling pathway; Pregnancy-related disorders; Trophoblast cells;Epithelial-mesenchymal transition

[中图分类号] R714.2

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）06（b）-0034-08

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25091635

[基金项目] 新疆维吾尔自治区卫生健康青年医学科技人才专项（WJWY-202009）。

▲通讯作者

（收稿日期：2025-09-21）

（修回日期：2026-01-15）