前列腺炎是泌尿生殖系统的常见疾病之一，其中慢性前列腺炎（chronic prostatitis，CP）占前列腺炎患者病例总数的90%以上，临床表现为持续性、反复性、难治性和部位多变性等特点[1-3]。有研究认为，CP发病机制可能与不明微生物感染、自身免疫异常、氧化应激等因素有关[4]。

癃清胶囊对CP具有较好疗效，能减轻患者症状及西药引发的不良反应[5]。其处方组成为败酱草、金银花、黄连、黄柏、白花蛇舌草、牡丹皮、赤芍、泽泻、车前子、仙鹤草，主要用于下焦湿热所致的热淋、尿频、尿急、尿痛等症状[6]。癃清胶囊虽对CP有一定的治疗作用，但其作用机制尚未完全明确。PI3K-Akt通路可能是其关键作用通路，其不仅在癌症中异常激活，也是炎症反应的核心通路[7-12]。人前列腺癌细胞DU145作为前列腺上皮来源的细胞系，PI3K-Akt信号通路活跃，通过在该模型上验证癃清胶囊对PI3K-Akt通路的抑制作用及其引发的细胞周期阻滞与增殖抑制，能为理解该药如何调控这一核心通路治疗CP提供间接实验证据和机制启示。本研究结合网络药理学预测与细胞实验验证，旨在阐明该药调控PI3K-Akt通路干预CP的潜在作用机制，为癃清胶囊的基础研究及临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验药物及制备

癃清胶囊（生产批号：20240306）购于贵州远程制药有限责任公司。精密称取20 mg癃清胶囊粉末，加入5 ml含10%胎牛血清的1640培养基中，涡旋3 min、超声30 min，经0.22 μm滤膜除菌后得到4 mg/ml的母液备用。

1.2 细胞

DU145细胞为河南中医药大学药剂实验室留存。

1.3 主要试剂

PI3K抗体（货号：GB11525）、Akt抗体（货号：GB15689）、p-PI3K抗体（货号：BS-5570R）、ACTIN抗体（货号：GB15003）、山羊抗兔二抗（货号：GB23303）均购自武汉赛维尔生物科技有限公司；CCK8试剂盒（货号：K1018）购自美国APExBIO公司。

1.4 主要仪器

Pannoramic MIDI扫描仪购自匈牙利3DHISTECH公司；SVE-2垂直电泳仪、SVT-2转印电泳仪、SCG-W3000化学发光仪购自武汉赛维尔生物科技有限公司；Multiskan GO酶标仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.5 实验方法

1.5.1 癃清胶囊主要化学成分与作用靶点的筛选 通过TCMSP数据库（https：//old.tcmsp-e.com/index.php/）以生物利用度 ≥30%、类药性 ≥0.18为条件；TCMIP数据库（https：//old.tcmsp-e.com/index.php/）与BATMAN-TCM数据库（https：//old.tcmsp-e.com/index.php/）以Score cutoff＞20，P＞0.05为条件获取癃清胶囊10味药材成分信息及对应成分靶点，若数据库中无靶点的成分使用PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、Swiss Target Prediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch//）以Probability＞0收集补充。以上数据汇总、去冗杂后通过UniProt蛋白质数据库将靶点名称标准化，最终获得癃清胶囊的成分靶点。

1.5.2 CP疾病靶点与成分-疾病交集靶点的收集 以“chronic prostatitis”为关键词，检索GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）（以Relevance score值重复两次取中位数以上为标准）、OMIM数据库（https：/www.omim.org/）及CTD数据库（https：//ctdbase.org/）获取靶点，去冗杂后得到与CP相关的疾病靶点。

运用微生信平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）得到CP疾病靶点与癃清胶囊成分靶点的交集靶点。1.5.3 蛋白质-蛋白质相互作用（proteinprotein interaction，PPI）网络的构建及核心靶点、核心成分的筛选 将交集靶点导入STRING数据库（https：//cn.string-db.org/），物种选择“Homo sapiens”、置信度为0.4，构建潜在靶点PPI网络；使用CytoScape 3.7.1软件借助CytoNCA插件以度中心性、紧密中心性、特征向量中心性参数均大于平均值为筛选条件，得到核心靶点。

1.5.4 京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析与“药材-成分-靶点-通路”网络图的构建 通过David数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）设置物种为“Homo sapiens”，进行通路富集分析。将核心靶点、化学成分、药材及通路信息导入CytoScape 3.7.1软件构建“药材-成分-靶点-通路”网络图。

1.5.5 分子对接 取核心成分对应核心靶点数目前5位的活性成分和PI3K-Akt信号通路上degree值前5位的核心蛋白进行分子对接。在PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载活性成分的结构通过Open Bable 2.3.2软件进行格式转换，在PDB数据库（http：//www.rcsb.org）中获取蛋白质分子的三维结构。采用AutoDockTools 1.5.7分子对接工具对蛋白结构进行去水、加氢处理，使用AutoDock Vina 1.1.2软件进行分子对接并计算结合能，运用PyMOL 2.6.0软件进行对接结果可视化。

1.5.6 细胞培养与分组 DU145细胞培养于含10%胎牛血清的1640培养基中，在37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。实验分为空白组、对照组、给药组，给药组用完全培养基稀释母液至所需浓度，对照组只含细胞与完全培养基，空白组只含完全培养基。

1.5.7 CCK8法检测癃清胶囊对DU145细胞增殖的影响 DU145细胞接种于96孔板中，培养24 h后分别加入含不同浓度（0、100、200、400、600、800 μg/ml）癃清胶囊的完全培养基孵育24 h，每孔加入10 μl CCK8溶液，避光孵育1.5 h，使用酶标仪在波长450 nm处测定吸光度（A），计算细胞活力，每组设置5个复孔。细胞活力=（A实验组-A空白组）/（A对照组-A空白组）×100%。

1.5.8 流式细胞术检验细胞周期 将DU145细胞接种于6孔板中，根据CCK8筛选结果，设置对照组和癃清胶囊低、中、高剂量组，每组设置3个复孔。细胞贴壁后加入癃清胶囊溶液培养48 h，消化离心，0.3 ml PBS重悬细胞。-20 ℃固定2～3 h，离心，PBS重悬细胞，离心弃上清液，加入100 μl RNaseA Reagent混匀，37 ℃水浴30 min，加入400 μl染液PI混匀，4℃避光孵育30 min后上机检测。

1.5.9 免疫荧光法检测PI3K、Akt蛋白表达 将DU145细胞接种于放有盖玻片的6孔板中，根据CCK8筛选结果，设置对照组和癃清胶囊低、中、高剂量组，每组设置3个复孔。细胞培养24 h，4%多聚甲醛固定，4% TritonX-100溶液通透，5% BSA封闭30 min，一抗[PI3K（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）]4 ℃湿盒孵育过夜，HRP-山羊抗兔二抗（1∶3 000）37 ℃避光孵育1 h，含DAPI的抗荧光猝灭剂封片。使用切片扫描仪数字扫描采集图像，Image J软件进行图像分析。

1.5.10 Western blot法检测PI3K、p-PI3K、Akt蛋白表达 将DU145细胞接种于6孔板中，根据CCK8筛选结果，设置对照组和癃清胶囊低、中、高剂量组，每组设置3个复孔。细胞培养24 h，BCA法测定蛋白浓度。每孔上样20 μg，电泳，转膜，5% BSA封闭1 h，一抗[PI3K（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）、p-PI3K（1∶1 000）、ACTIN（1∶5 000）]4 ℃孵育过夜，洗膜后孵育HRP-山羊抗兔二抗（1∶3 000）。ECL发光显影，使用Image J软件进行图像分析。

1.6 统计学方法

采用SPSS 27.0统计学软件进行数据分析，Graph-Pad Prism 9.5软件绘制统计图。计量资料用均数±标准差（）表示，比较采用t检验或单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癃清胶囊化学成分与成分靶点的收集

共计获取癃清胶囊238个有效成分，对应靶点1 290个。

2.2 CP疾病靶点与成分-疾病交集靶点的收集

获得CP相关疾病靶点1 870个。将癃清胶囊成分靶点与CP疾病靶点取交集，得到393个治疗CP的潜在作用靶点。

2.3 PPI网络构建及核心靶点与核心成分的筛选

通过PPI分析，筛选得到85个节点，排名靠前的核心靶点主要为Akt1、TNF、IL-6、ALB、TP53、EGFR等，见图1。根据成分对应核心靶点数目筛选出癃清胶囊治疗CP的主要核心成分，可能为黄芩素、槲皮素、2-十七酮、山柰酚、木犀草素等。

图1 核心靶点PPI网络

2.4 KEGG通路富集与“药材-成分-靶点-通路”网络图的构建

KEGG通路富集分析共获得163条信号通路，主要涉及PI3K-Akt、AGE-RAGE、IL-17等信号通路。显著性前20条通路气泡图见图2，“药材-成分-靶点-通路”网络图见图3。

图2 KEGG通路分析

图3 “药材-成分-靶点-通路”网络

2.5 分子对接

选择PI3K-Akt信号通路上degree值前5位的核心靶点为蛋白质受体，黄芩素、2-十七酮、山柰酚、木犀草素、槲皮素为成分配体进行分子对接验证，分子对接结合能热图见图4。结果显示，配体与受体结合能＜-5.0 kcal/mol的成分占80%，44%的成分和靶点对接得分＜-7 kcal/mol，因而靶点与成分间具有较好的结合活性。癃清胶囊核心成分与Akt1、EGFR、IL-6蛋白结合能力均较好，靶点蛋白与潜在活性化合物分子间主要以氢键进行结合且结合较为稳定，对接状态良好，结合能最低的3种分子对接模式见图5。

图4 代表性配体与靶蛋白的结合能得分热图

图5 配体与受体蛋白对接示意图

2.6 CCK8法检测癃清胶囊对DU145细胞增殖的影响

癃清胶囊给药浓度升高，细胞活力呈下降趋势。后续实验以200 μg/ml为癃清胶囊低剂量组、400 μg/ml为癃清胶囊中剂量组、800 μg/ml为癃清胶囊高剂量组。见图6。

图6 DU145细胞相对生长活力（n=5）

2.7 癃清胶囊对DU145细胞周期的影响

癃清胶囊低、中、高剂量组与对照组G0/G1期细胞比例比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照组比较，癃清胶囊高剂量组S期、G2/M期细胞比例降低（P＜0.01）。见图7。

图7 各组细胞周期比较（n=3）

2.8 癃清胶囊对前列腺癌DU145细胞PI3K、p-PI3K、Akt蛋白表达的影响

免疫荧光结果显示，PI3K与Akt蛋白在胞质内表达，分别显示红色和绿色荧光。与对照组比较，癃清胶囊低、中、高剂量组Akt蛋白表达量降低（P＜0.01）；癃清胶囊中、高剂量组PI3K蛋白表达量降低（P＜0.01）。见图8。

图8 各组PI3K、Akt蛋白表达比较

Western blot结果显示，与对照组比较，癃清胶囊低、中、高剂量组p-PI3K、PI3K、Akt 蛋白量降低（P＜0.01）。见图9。

图9 各组p-PI3K、PI3K、Akt蛋白表达比较

3 讨论

中医古籍中虽并无“慢性前列腺炎”的病名，但CP相关的症状与古医籍中的“白浊”“精浊”“尿浊”等病症描述重合或相似[3]。中医药治疗主要以多成分、多靶点、多通路协同产生作用。

在成分方面，本研究发现黄芩素、槲皮素、2-十七酮、山柰酚、木犀草素等可能是癃清胶囊治疗CP的潜在核心成分。泽泻三萜类化合物具有利尿、调脂、抗菌作用[13-14]。槲皮素、山柰酚属于黄酮类化合物，可通过调控IL-6、TNF-α等蛋白发挥抗氧化和抗炎作用，进而改善前列腺肥大症状[15-16]。

在靶点及通路方面，本研究发现癃清胶囊治疗CP的核心靶点为TP53、EGFR、CTNNB1、Akt1、INS、ALB等；癃清胶囊可能通过调控PI3K-Akt通路发挥治疗CP的作用。PI3K-Akt通路与抗炎、抗氧化和抗肿瘤相关，研究发现调节细胞凋亡与氧化应激会使前列腺细胞增殖加剧[17]。Akt1在参与炎症反应及肾损伤期间被激活，可激活TGF-β1信号传导，导致肾小管间质纤维化、肾小管上皮细胞去分化、肾小球硬化等[18-19]。TNF可诱导核因子κB的表达及IKK的磷酸化，促使炎症反应发生[20]。细胞因子IL-6能够激活淋巴细胞分化，还可抑制粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、γ干扰素等前列腺炎相关炎症细胞因子的产生[21-22]。分子对接结果显示，成分配体与PI3K-Akt信号通路上的蛋白受体均有较好的结合活性，提示使用网络药理学研究癃清胶囊作用机制具有一定可靠性[23]。

癃清胶囊对于PI3K-Akt通路的上下游靶点皆具有调控作用，PI3K和Akt是PI3K-Akt通路中的核心因子，多味药材作用于RKT、TLR、Cytokine R蛋白，由败酱草、金银花、黄柏、黄连、白花蛇舌草、仙鹤草、泽泻、牡丹皮共同调控的PI3K蛋白，将信号传递给Akt，Akt由败酱草、金银花、黄柏、黄连、白花蛇舌草、赤芍、仙鹤草、泽泻、牡丹皮共同调控，Akt蛋白磷酸化下游由败酱草、金银花、牡丹皮共同参与调控的GSK3蛋白，败酱草、金银花、牡丹皮、仙鹤草调控的IKK蛋白，以及败酱草、仙鹤草、金银花调控的MDM2细胞因子抑制凋亡基因的表达，从而促进细胞存活。因此，败酱草和金银花可能通过抑制此通路关键靶点（PI3K、Akt）表达，进而抑制下游通路表达，与白花蛇舌草、黄柏、黄连等共同作用，起到治疗CP的作用。

有研究借助脂多糖诱导的DU145、PC-3前列腺癌细胞系发现，炎症小体NLRP3与前列腺癌炎症细胞浸润密切相关，为揭示炎症与前列腺癌的关系提供研究基础[24]。本研究使用DU145细胞系并非旨在模拟CP的完整病理生理环境，而是基于其对目标通路（PI3K-Akt）的高度敏感性及对“癃清胶囊能够抑制PI3K-Akt通路”这一核心假设进行直接验证。基于此目的，本研究通过CCK8法及流式细胞术发现，癃清胶囊可以抑制DU145细胞活力；癃清胶囊可能通过加快细胞由G1期转变至S期，阻滞S期转变至G2期，也可能加快G2期转向M期发挥抑制DU145细胞增殖作用；以及通过免疫荧光法及Western blot法验证癃清胶囊对PI3K-Akt信号通路的影响。

本研究发现，癃清胶囊可能通过抑制PI3K-Akt信号通路发挥治疗CP的作用，可为研究癃清胶囊整体治疗CP的作用机制提供理论参考，未来将采用脂多糖诱导的前列腺上皮细胞炎症模型及体内动物实验，进一步证实癃清胶囊在炎症环境下通过该通路发挥的治疗作用。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Investigation of the potential mechanism of Longqing Capsules in intervening chronic prostatitis by regulating PI3K-Akt signaling pathway based on network pharmacology and experimental validation

WANG Yaqian JIA Mengxiao LIU Yang GUO Yirui LIU Gaizhi

School of Pharmacy, Henan University of Chinese Medicine, Henan Province, Zhengzhou 450046, China

[Abstract] Objective To investigate the potential mechanism of action of Longqing Capsules in the treatment of chronic prostatitis (CP). Methods TCMSP database, TCMIP database, BATMAN-TCM database, PubChem database, and Swiss Target Prediction database were used to obtain the main chemical components and corresponding targets of each medicinal material of Longqing Capsules; the targets related to CP were screened using the GeneCards database, OMIM database, and CTD database; and the intersection targets of CP and Longqing Capsules were obtained by using the bioinformatics online platform. The proteinprotein interaction (PPI) network was constructed using STRING database and Cyto-Scape 3.7.1 software and core targets and core active components were screened out. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathways were enriched and analyzed using David database. The molecular docking was conducted using AutoDockVina 1.1.2 software. Adenocarcinoma DU145 cells were divided into control group and low-dose,medium-dose, and high-dose groups of Longqing Capsules.The cell cycle distribution of DU145 cells was detected by flow cytometry, and the expression of proteins related to the PI3K-Akt signaling pathway was detected by immunofluorescence and Western blot. Results Longqing Capsules contain 238 active ingredients, 1 290 targets, 1 870 targets related to CP diseases, and 393 intersection targets. PPI analysis and screening yielded 85 nodes, including TP53, IL-6, and EGFR, etc. The main core ingredients of Longqing Capsules in treating CP may include baicalein, quercetin, 2-heptadecone, kaempferol, and luteolin, etc. A total of 163 signaling pathways were obtained through KEGG enrichment analysis, mainly involving PI3K-Akt, IL-17, and other signaling pathways. The results of molecular docking showed that the docking activity between the core targets on the PI3K-Akt signaling pathway and the potential active components was good. Compared with the control group, the proportion of cells in the S phase and G2/M phase in the high-dose Longqing Capsules group decreased (P＜0.01). Immunofluorescence results showed that, compared with the control group, the expression of Akt protein in the low-dose, mediumdose, and high-dose groups of Longqing Capsules decreased (P＜0.01); the expression of PI3K protein in the mediumdose and high-dose groups of Longqing Capsules decreased (P＜0.01). Western blot results showed that, compared with the control group, the p-PI3K, PI3K, and Akt proteins in the low-dose, medium-dose, and high-dose groups of Longqing Capsules decreased (P＜0.01). Conclusion Longqing Capsules may exert its therapeutic effect on chronic prostatitis by inhibiting the PI3K-Akt signaling pathway.

[Key words] PI3K-Akt signaling pathway; Longqing Capsules; Chronic prostatitis; Mechanism of action

[中图分类号] R285

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）06（b）-0073-08

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25091811

[基金项目] 河南省自然科学基金项目（252300423800）；河南省高等学校重点科研项目（25A350007）。

[作者简介]

王雅倩（2001-），女，河南中医药大学药学院2024级药学专业在读硕士研究生；研究方向：天然产物修饰和新剂型开发。

[通讯作者] 刘改枝（1981-），女，博士，教授，硕士生导师，主要从事天然产物修饰、新剂型开发和神经药理学研究工作。

（收稿日期：2025-09-53）

（修回日期：2026-02-02）