犬科动物狗Canis familiaris L.的外生殖器（阴茎和睾丸）在《中华本草》[1]中称为狗鞭，在《新编中药志》[2]中称为狗肾，是中医传统“外肾”类中药。狗肾药用历史悠久，最早收载于《神农本草经》，具有暖肾、壮阳、益精的功效；据统计，中药成方制剂中七鞭回春乐胶囊、三鞭胶囊、三肾丸、回春如意胶囊等49种中成药的处方中均含有狗肾[3]。狗肾药材质量标准收载于《中华人民共和国卫生部药品标准（中药材第一册）》[4]、《安徽省中药饮片炮制规范》[5]、《湖南省中药材标准》[6]等多个地方标准或炮制规范中，但多数仅收载性状检测项目，少数收载水煮形态膨大及阴茎骨鉴别或醋酐-硫酸化学反应鉴别等，存在过度依赖外观鉴别经验或方法专属性不足等问题，易出现错判误判[7-9]。目前，关于狗肾的化学成分基础研究较少，难以从理化专属性成分的角度实现对狗肾药材及饮片的有效质控。

狗肾基原动物为犬科动物狗，以黄狗肾为主[10-12]；由于偷盗家犬或非法捕杀流浪犬形成的黑色供应链存在，导致狗肾规格多样且难以鉴别。陈代贤等[13]研究发现，狗肾经形态调整后可以伪充海狗肾，更有发现用鸡、鸽子或其他动物的小腿骨外贴动物肌肉、肌健，表面再包一层动物皮膜，仿照狗肾形状加工的假狗肾，或者在狗肾中钉入铁钉、小骨头等以增加狗肾重量的掺假现象，提示鞭类中药材的外观形态易受人为改造，被不法分子利用以谋利。近年来，随着分子生物学技术的发展和在中药分析领域的应用，基于DNA差异的特异性PCR鉴别技术已用于蕲蛇、乌梢蛇等真伪鉴别[14-16]；并自2010年始收载于《中华人民共和国药典》[17]，为依赖于传统外观性状鉴别的动物类中药材提供更客观的技术方法。本研究首次采用二步法建立中药狗肾PCR鉴别方法，并结合DNA条形码COI基因分析，对市售27批标示狗肾样品进行鉴别，以考察目前市场上狗肾的质量情况，为促进标准提高及加强市场监管提供研究基础及方法依据。

1 对象与方法

1.1 研究样本

从屠宰场采集来源确切的并已干燥的正品狗肾样本3批（批号：20230301、20230302、20230303），作为阳性对照；在安徽亳州、河北安国等中药材专业交易市场及3家不同医药公司，根据商品大小长短等不同规格，收集标示狗肾样品27批（编号：S1～S27）用于验证；同时将非澳海狗肾标本作为阴性对照。以上样本均经广东省药品检验所检验技术研究室/监督检验研究室杨志业主任中药师鉴定，样本及相关信息均保存于广东省药品检验所中成药室/中药材（饮片）室。

1.2 主要设备与试剂

超微量分光光度计（美国ThermoFisher Scientific公司，型号：NanoDrop One）；PCR仪（美国Bio-Rad公司，型号：T100）；电泳仪（美国Bio-Rad公司，型号：Sub-Cell）；凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司，GelDoc XR+）。

血液/细胞/组织基因DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司，货号：DP304]；Ex Taq（日本宝日医生物技术公司，货号：RR001A）；DL1000 DNA Marker（日本宝日医生物技术公司，货号：3591A）；聚乙烯吡咯烷酮-40、曲拉通X-100、氢氧化钠、Tris-盐酸溶液（pH 8.0）等均为分析纯或生化试剂。

1.3 引物合成

D-loop正向引物：5’-TCCAGGTAAACCCTTCTT-3’，引物大小：18 bp；反向引物：5’-TACGAGCAAGGGTT-GATGG-3’，引物大小：19 bp[18]。DNA条形码COI基因通用引物HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCA-AAAAATCA-3’，引物大小：26 bp；LCO1490：5’- GGT-CAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，引物大小：25 bp[17]。以上引物均由北京六合华大基因科技有限公司（广州分公司）合成。

1.4 研究方法

1.4.1 模板DNA提取 狗肾、阳性及阴性对照品用75%乙醇擦拭表面，晾干，剪碎，分别取约30 mg，用珠式细胞破碎仪粉碎。采用试剂盒对狗肾（批号：20230301）的模板DNA进行提取[19-20]；所得DNA采用超微量分光光度计测定。

1.4.2 狗肾PCR鉴别方法建立 通过比较不同退火温度（54、56、58、60 ℃）、变性/退火时间（30 s/30 s，30 s/45 s，45 s/45 s）、循环次数（28、30、32、35次）、正反向引物加入量（各0.2、0.3、0.4、0.5 μl）、DNA模板加入量（0.25、1.00、10.00、100.00 ng）对PCR结果的影响，确定狗肾PCR扩增体系及反应条件。

1.4.3 PCR-电泳鉴定D-loop片段 采用“1.4.2”项下方法，以D-loop引物为扩增引物，对27批狗肾样品进行鉴定。PCR产物采用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.4.4 PCR-测序比对DNA条形码COI基因 以DNA条形码COI基因通用引物为扩增引物，按照《中华人民共和国药典》[17]四部通则9107中药材DNA条形码COI基因序列扩增方法对3批狗肾样本及27批狗肾样品进行扩增并测序，扩增产物由北京六合华大基因科技有限公司（广州分公司）采用一代测序方法进行双向测序。测得序列去除引物和低质量区域后，将序列在GenBank数据库（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中使用BLAST工具进行结果判定，结果中相似性最高的序列对应物种为待测样品最接近的物种。两组序列在欧洲生物信息学研究所分析平台（https：//www.ebi.ac.uk/jbdispacher）应用在线Needles工具进行pairwise分析。采用MEGA 6.0软件对获得的序列进行比对，利用邻接法构建系统聚类树，同时以Bootstrap 1 000次以检验各分支的支持率（仅显示支持率 ≥60%）。

2 结果

2.1 狗肾PCR方法参数确定

以扩增效果及耗时为考量指标确定狗肾PCR鉴别参数条件为：PCR反应总体积为25 μl，包括10×PCR缓冲液（含Mg2+）2.5 μl，dNTP（10 mmol/L）2.0 μl，D-loop正反向引物（10 μmol/L）各0.2 μl，Taq DNA聚合酶（5 U/μl）0.2 μl，模板（0.25～100.00 ng/μl）1 μl，无菌超纯水18.9 μl。反应条件：95 ℃预变性5 min，循环反应30次（95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s），延伸（72 ℃）5 min。见图1。

图1 狗肾PCR鉴别方法关键参数考察结果

2.2 27批狗肾样品PCR鉴别检测

22批狗肾样品（编号：S1～S22）凝胶电泳图谱中，在200～300 bp检出单一DNA条带，判定为正品；5批（编号：S23～S27）未检出相应条带，判定为非正品；非澳海狗肾阴性对照及空白对照无条带。见图2。

图2 狗肾PCR鉴别方法检测结果

2.3 DNA条形码COI基因序列检测

经测序获得30条序列，以狗肾样本（批号：20230301）及狗肾样品（编号：S23）的测序峰图为代表，测序峰图见图3。分别去除引物和低质量区域后，获得的序列长度均为628 bp。比对结果显示，3批狗肾样本及狗肾样品（编号：S1～S22）的序列与犬Canis familiaris L.的序列相似度均为100%，狗肾样品（编号：S23～S27）序列与欧亚野猪Sus scrofa L.的序列相似度为100%，见表1。以狗肾样本（批号：20230301）与狗肾样品（编号：S23）为代表展示序列比对结果图，见图4。以DNA条形码COI基因序列对狗肾PCR鉴别方法的结果进行验证，方法可行，见图5。

表1 狗肾BLAST结果

样品与序列最接近的物种拉丁名序列相似度（%）GenBank登录号狗肾样本（批号：20230301～20230303）Canis familiaris L.100OR260549.2、OR260563.2、KU290605.1、OQ340342.1、狗肾样品（编号：S1～S22）KM061517.1狗肾样品（编号：S23～S27）Sus scrofa L.100PQ388341.1、PX412414.1、PQ388506.1、PQ388908.1、PQ388813.1

图3 测序结果

图4 狗肾与欧亚野猪Sus scrofa L.序列比对结果

图5 基于COI序列构建的狗肾与欧亚野猪NJ树

3 讨论

D-loop区是线粒体基因组中进化速度最快的区域，具有高度的序列多态性，作为分子标记在PCR技术中广泛应用。本研究所建立的狗肾特异性PCR鉴别方法，将DNA分子鉴定技术应用于中药狗肾的定性鉴别。在反应程序中采用二步法（每个循环仅包括变性、退火两个步骤）进行扩增，缩短检测时间，提高检测效率。

预实验中，本研究使用3种主流品牌及常用方法（碱裂解法）对模板DNA的提取方法进行考察，发现市售试剂盒均能提取获得满足PCR要求的模板DNA，而且碱裂解法可在10 min内完成DNA提取，效率高，可用于中药狗肾快速PCR方法的开发。因狗肾含动物油脂，选取肌肉组织进行提取效果最佳。同时，除使用Ex Taq进行检测外，还对PCR扩增反应中不同仪器（型号：T100、TC-S、ABI ProFlex）和不同聚合酶（Premix Taq、2×Taq PCR Master MixⅡ、2×Taq Master Mix等8种）进行比较，发现对扩增结果均无影响，提示本方法耐用性良好。

经DNA基因条形码COI基因序列测定，发现27批狗肾样品中有5批样品序列与欧亚野猪 Sus scrofa L.的序列相似度为100%，是对以野猪鞭伪充狗肾的首次发现。有研究报道，随着生态环境的改善和野生动物保护力度的加强，野猪种群数量呈现快速增长态势，其栖息地范围不断扩大[21-22]。据国家林草局公布的数据，截至2024年11月，我国野猪数量达200万头，在28个省（直辖市、自治区）均有分布，在其中26个省（直辖市、自治区）致害。而野猪鞭与狗肾在外观性状鉴别上难以区分，在野猪数量资源激增并且严重影响人类生活的情况下，野猪鞭随之进入市场。关于野猪鞭的药用历代本草鲜有记载，药用情况不明，应多加关注。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

[参考文献]

[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会. 中华本草：第二十七卷[M]. 上海：上海科学技术出版社，1999：565-566.

[2] 肖培根. 新编中药志：第四卷[M]. 北京：化学工业出版社，2002：565-566.

[3] 刘冠群，吴哲，张娇，等. 山西药用动物应用现状及问题对策探讨[J]. 中国中医药信息杂志，2020，11（11）：10-16.

[4] 中华人民共和国卫生部药典委员会. WS3-B-0689-91 中华人民共和国卫生部药品标准（中药材第一册）[S]. 1992：57.

[5] 安徽省药品监督管理局. 安徽省中药饮片炮制规范[S].合肥：安徽科学技术出版社，2019：192.

[6] 湖南省卫生厅. 湖南省中药材标准[S]. 长沙：湖南科学技术出版社，1993：196-197.

[7] 辽宁省食品药品监督管理局. 辽YCBZ 0030-2009 辽宁省中药材标准（第一册）[S]. 沈阳：辽宁科学技术出版社，2009：125-127.

[8] 黑龙江省药品监督管理局. 黑龙江省中药材标准[S].2001：135-136.

[9] 福建省食品药品监督管理局. FJSZ-2006-0052 福建省中药材标准[S]. 福州：海风出版社，2006：144-145.

[10] 浙江省卫生厅. 浙江省中药炮制规范[S]. 杭州：浙江科学技术出版社，1986：588.

[11] 贵州省药品监督管理局. DB 52/YC245-2003 贵州省中药材民族药材质量标准[S]. 贵阳：贵州科技出版社，2003：252.

[12] 上海市药品监督管理局. YP1002303001029 上海市中药饮片炮制规范[S]. 上海：上海科学技术出版社，2018：550.

[13] 陈代贤，任玮，郭秋月，等. 黄狗肾伪充海狗肾的鉴别图解[J]. 中药材，1998，21（10）：504-505.

[14] 马梅，李薇，龚玲，等. 基于COI和16rRNA基因的地龙药材及其混淆品的DNA条形码鉴定[J].中药新药与临床药理，2014，25（5）：595-598.

[15] 张欢欢，徐金娣，周静，等. 基于COI条形码的市售蝉蜕及其混淆品DNA分子鉴定研究[J]. 中草药，2024，55（6）：2057-2065.

[16] 熊希然，李莎，金凡森，等. 基于DNA条形码技术鉴别九香虫类药材[J]. 中药材，2024，47（12）：2996-3000.

[17] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典[S].北京：中国医药科技出版社， 2020.

[18] 中国检验检疫科学研究院，青岛出入境检验检疫局，辽宁出入境检验检疫局，等. GB/T 21105-2007 动物源性饲料中狗源性成分定性检测方法PCR方法[S]. 北京：中国标准出版社，2008：1-4.

[19] 蒋超，黄璐琦，袁媛，等. 使用碱裂解法快速提取药材DNA方法的研究[J]. 药物分析杂志，2013，33（7）：1081-1090.

[20] 郑琪，蒋超，黄璐琦，等. 碱裂解法快速提取中药炒制品DNA的研究[J]. 中国中药杂志，2014，39（19）：3678-3683.

[21] 苗震，芦欣怡，周学红，等. 野猪与人冲突防控对策研究的系统评价[J]. 生态学报，2022，42（6）：2501-2509.

[22] 张航航. 南陵县野猪种群资源现状调查[J]. 安徽农学通报，2025，31（13）：76-78.

Identification of dog penis and their adulterants based on D-loop fragments and COI gene

TAN Yingyi1 YANG Zhiye2 WU Yueli1

1.Department of Traditional Chinese Medicine Final Products/Traditional Chinese Medicine Materials, Guangdong Institute for Drug Control, Guangdong Province, Guangzhou 510663, China; 2.Department of Analytical Technology/Department for Supervision Testing and Researches, Guangdong Institute for Drug Control, Guangdong Province,Guangzhou 510663, China

[Abstract] Objective To study the PCR identification method for dog penis using D-loop fragments and COI gene analysis to distinguish dog penis from their adulterants. Methods By comparing the effects of different annealing temperatures, denaturation/annealing times, cycle numbers, the addition amounts of forward and reverse primers, and the addition amounts of DNA templates on the PCR results, the PCR amplification system and reaction conditions of dog penis were determined. Using D-loop fragments as amplification primers, 27 batches of dog penis samples were identified. Using the universal primers of the COI gene as amplification primers, the PCR identification test results of 27 batches of dog penis samples were confirmed. Results The total volume of the PCR reaction was 25 μl. The reaction conditions were pre-denaturation at 95 ℃ for 5 minutes, 30 cycles of reaction (95 ℃ for 30 seconds, 56 ℃ for 30 seconds), and extension (72 ℃) for 5 minutes. The 22 batches of dog penis samples were genuine products. They could be amplified to obtain a single band of 200-300 bp, and the primary species was canine Canis familiaris L. Conclusion The PCR identification method established in this study is simple, rapid, and accurate, making it suitable for authenticating dog penis. Furthermore, this study reports the use of Eurasian wild boar penis as an adulterant of dog penises, providing technical support for quality control of dog penis medicinal materials.

[Key words] Dog penis; D-loop fragments; COI gene; Identification

[中图分类号] R282

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）06（c）-0015-06

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25091245

[基金项目] 广东省药品检验所科研项目（SN2023005）；广东省基础与应用基础研究基金项目（2022A1515011850）。

[作者简介]

谭颖仪（1987-），女，副主任中药师，主要从事中药质量研究及分子生物学检测工作。

[通讯作者] 杨志业（1981-），女，硕士，主任中药师，主要从事中药鉴定及质量评价研究工作。

（收稿日期：2025-09-16）

（修回日期：2026-02-26）