桑叶为桑科植物桑Morus alba L.的干燥叶，临床常用于发散风热、清肺润燥及清肝明目，亦为药食同源之品，其质量直接影响临床用药的有效性和安全性，故建立科学、全面的鉴定与质量评价体系至关重要[1]。桑属植物包含多个种，如奶桑Morus macroura Miq.、黑桑Morus nigra L.、川桑Morus notabilis C. K.Schneid.等传统手段难以将桑叶与其近缘种进行区分，且不同品种对应的功效功能存在差异，不可混用[2-3]。目前2025年版《中华人民共和国药典》[4]仅以芦丁为测定指标，存在一定局限性，难以全面评价桑叶药材整体质量。此外，桑叶相关的鉴定研究较少，且局限于特定地区，代表性不足[5]。

2003年，生物学家Paul Hebert首次提出DNA条形码技术，为物种鉴定提供了新途径[6]。目前共有3条通用序列，其中ITS2具有序列短、种内差异显著低于种间差异、通用性强和扩增成功率高的优点，已在多种药材的鉴定中广泛使用[7-16]。同时，HPLC特征图谱技术是目前应用广泛的中药材评价技术，通过HPLC分析得到药材的共有峰图谱，并辅以相似度评价等方法，实现药材的质量评价，已成为中药材质量评价的重要手段。

本研究以不同省区的桑叶药材及其近缘种为对象，利用ITS2序列进行DNA鉴定，构建HPLC特征图谱，联合化学计量学分析，构建“DNA鉴定+质量评价”一体化评价方法，旨在为桑叶的DNA鉴定与质量评价提供科学参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 可调式混匀仪（MX-S，大龙兴创实验仪器北京股份有限公司）；高速微量离心机（D2012，美国SCILOGEX公司）；数显电子恒温水浴锅（HH-4，常州国华电器有限公司）；高通量组织研磨仪（SCIENTZ-6，宁波新芝生物科技股份有限公司）；电热鼓风干燥箱（PHG-9076H，上海精密实验设备有限公司）；基因热循环仪（2720 Thermal Cycler，赛默飞世尔科技公司）；电泳仪（DYY-6C，北京市六一仪器厂）；高效液相色谱仪（LC-16，日本岛津公司）；微量UV-Vis分光光度计（NanoDrop One，赛默飞世尔科技公司）

1.1.2 试剂 2×含蓝染料Taq PCR Mix预混液（货号：B639295，武汉生工生物工程股份有限公司）；10 000×水溶液4SGelred核酸染料（货号：A616697，武汉生工生物工程股份有限公司）；Sterilized H2O（货号：B639295-0005，武汉生工生物工程股份有限公司）；DP305离心柱型植物基因组DNA提取试剂盒（批号：A0827B 25-01-26，北京天根生化科技有限公司）；无水乙醇（批号：20240912，中国医药集团有限公司），无水甲醇（批号：20241011，中国医药集团有限公司），巯基乙醇（批号：20230403，成都市科隆化学品有限公司），均为分析纯；甲醇（批号：20250322，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），为色谱纯；绿原酸（批号：DSTDL002103）、异槲皮苷（批号：DSTDY000604）、隐绿原酸（批号：DSTDY003503）、芦丁（批号：DSTDL001702）、山柰酚（批号：DSTDS005604）、新绿原酸（批号：DSTDX001505）、紫云英苷（批号：DSTDZ000103）、异绿原酸A（批号：DSTDX001505）、异绿原酸B（批号：DSTDX001505）、异绿原酸C（批号：DSTDX001505），以上对照品纯度均 ≥98%，均购自成都乐美天医药科技有限公司。

1.1.3 样品 以桑叶药材样品、黑桑干燥果实和川桑、奶桑原植物新鲜叶片为实验对象。药材、果实用水清洗，晾干后用硅胶保存，新鲜叶片采集后保存于硅胶中，临用前低温干燥。S1~S31、P1~P6样品均经武汉理工大学刘霞教授鉴定。1~9号ITS2序列来源于NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore），见表1。

表1 桑叶及其近缘种样品信息

编号物种名样品名来源编号物种名样品名来源S1~S6桑（药材）M. albaSY1-6广西玉林P5~P6奶桑 Morus macrouraNS1-2云南西双版纳S7~S11桑（药材）M. albaSY7-11安徽亳州1黑桑Morus nigraKF784875.1NCBI S12~S16桑（药材）M. albaSY12-16湖北安陆2红果桑Morus rubraHQ144183.1NCBI S17~S19桑（药材）M. albaSY17-19河北安国3蒙桑Morus mongolicaKF784879.1NCBI S20~S22桑（药材）M. albaSY20-22河南周口4华桑Morus cathayanaKF784882.1NCBI S23~S25桑（药材）M. albaSY23-25山东菏泽5奶桑Morus macrouraOP296981.1NCBI S26~S28桑（药材）M. albaSY26-28云南昆明6川桑Morus notabilisKT002543.1NCBI S29~S31桑（药材）M. albaSY29-31河南南阳7水蛇麻Fatoua villosaKM586395.1NCBI P1~P2黑桑Morus nigraHS1-2新疆乌鲁木齐8牛筋藤Malaisia scandensKT002560.1NCBI P3~P4川桑Morus notabilisCS1-2四川眉山9桑M. albaKF784881.1NCBI

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳和测序 精密称取样品各40 mg，置于2 ml离心管中，用高通量组织研磨仪研磨，按照植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提取所有样品的DNA；使用超微量紫外分光光度计检测提取DNA的浓度和纯度，测定A260/A280值。按照《中国药典中药材DNA条形码标准序列》[17]中方法，使用生工生物工程股份有限公司（武汉）合成的ITS2引物进行扩增。PCR体系为25 μl，其中包含：ITS2F正向引物5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’、ITS3R反向引物5’-GACGCTTCTCCAGA CTACAAT-3’各1 μl（浓度10 μmol）、2×Taq PCR Mix 12.5 μl、ddH2O 8.5 μl、DNA模板2 μl。扩增程序:预变性94 ℃5 min；变性94 ℃ 30 s，退火56 ℃ 30 s，延伸72 ℃45 s，35个循环；延伸72 ℃ 10 min。扩增产物4 ℃保存，经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离后，均呈现单一且清晰的条带，所有合格产物均送至生工生物工程股份有限公司（武汉）完成双向测序。

1.2.2 数据处理 测序结果经CodonCode Aligner拼接、校对，除去低质量区和引物区；利用MEGA 11.0软件对所处理过的37条样品DNA序列及8条近缘种DNA序列进行对比，明确变异位点，将对比后的所有序列基于Kimura 2-parameter（K2P）模型构建NJ树，同时以Bootstrap方法重复1 000次，如果同一物种的所有样品形成一个单系，则认为该物种被准确鉴定[18-19]；同时，将处理后的37条样品DNA序列导入NCBI网站逐一进行BLAST相似性对比。

1.2.3 色谱条件 采用Kromasil 100-5-C18（4.6 mm× 250 mm，4 μm）色谱柱；以甲醇（A），0.1%三氟乙酸水（B）为流动相，洗脱程序：0~10 min，8%→10%A；10~16 min，10%→20% A；16~26 min，20%→25% A；26~31 min，25% A；31~36 min，25%→30% A；36~37 min，30%→40% A；37~47 min，40%→60% A；47~48 min，60%→8% A；48~53 min，8%→8% A；检测波长320 nm；柱温30 ℃；流速1 ml/min；进样量10 μl。

1.2.4 供试品制备 精密称取S28桑叶粉末（过5号筛）1.00 g于具塞锥形瓶，加入50 ml 50%甲醇，超声30 min，取出，放冷后过滤于50 ml容量瓶，用50%甲醇定容，即得（注入液相色谱前过0.22 μm微孔滤膜）。

1.2.5 对照品制备 精密称定绿原酸、异槲皮苷、异绿原酸A、异绿原酸C、新绿原酸、紫云英苷、隐绿原酸、山柰酚、芦丁、异绿原酸B适量于20 ml量瓶，加入50%甲醇，超声使其溶解，定容，制成每1 ml中含有上述对照品各46.50、53.41、38.51、33.71、30.72、25.19、43.51、24.16、38.51、34.45 μg，即得。

1.3 方法学验证

1.3.1 精密度考察 取桑叶药材（S28）样品，按上述“2.2.2”项方法制备供试品，按“2.2.1”项色谱条件连续进样6次，选择峰8为参照峰（S），计算各共有峰的相对保留时间RSD和相对峰面积RSD，结果显示上述RSD分别小于0.3%、小于3.0%，提示仪器精密度良好。

1.3.2 重复性考察 取桑叶药材（S28）样品，按上述“2.2.2”项方法平行制备6份供试品，按“2.2.1”项色谱条件进样，选择峰8为参照峰（S），计算各共有峰的相对保留时间RSD和相对峰面积RSD，结果显示上述RSD分别小于0.1%、小于5.0%，提示该方法重复性良好。

1.3.3 稳定性考察 取桑叶药材（S28）样品按上述“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项色谱条件于制备后0、4、8、12、24、30 h进样，选择峰8为参照峰（S），计算各共有峰的相对保留时间RSD和相对峰面积RSD，结果显示上述RSD分别小于1.0%、小于5.0%，提示供试品溶液在30 h内稳定性良好。

2 结果

2.1 DNA条形码鉴定

2.1.1 DNA提取、PCR扩增和测序 31批桑叶样品的扩增成功率和测序成功率均为100%，经琼脂糖凝胶电泳得到PCR扩增后产物电泳图，扩增效果较好,条带明亮，均存在一定程度的拖尾现象，见图1。微量紫外分光光度计检测结果显示，不同产地之间的DNA浓度存在差异，最大浓度36.78 ng/μg，最低浓度7.26 ng/μg。

图1 PCR电泳图（M：D2000 DNA Marker）

2.1.2 序列分析 处理后的37条序列，导入NCBI网站进行BLAST相似性比对，结果显示S1~S31与桑Morus alba L.，P1、P2与黑桑Morus nigra L.，P3、P4与川桑Morus notabilis C. K. Schneid.，P5、P6与奶桑Morus macroura Miq，样品与其各自对应的基原物种之间的相似性最高，初步鉴定为桑叶药材及其同属近缘种。经MEGA 11.0软件分析对比后，桑叶及其同属近缘种的ITS2序列比对后长度分别处于230~236 bp和233~236 bp。种内和种间GC含量、遗传距离和变异位点等信息见表2，31批桑叶样品种内遗传距离为0.000 0~0.017 4，桑叶与近缘种种间遗传距离为0.000 0~0.042 1，平均种内、种间遗传距离分别为0.005 12、0.021 73。

表2 桑叶及其近缘种ITS2序列对比信息

序列信息（物种）对比后序列长度（bp）GC含量（%）遗传距离变异位点总数（%）种内（桑叶）230~23664.75~66.510.000 0~0.017 416种间（全部序列）233~23660.77~65.430.000 0~0.042 1145

2.1.3 NJ树分析 将得到的37批样品序列和NCBI网站下载的序列导入MEGA 11.0软件，构建NJ树，见图2。由NJ树结果可见：31批不同产地的桑叶样品聚为一支，为同一物种；新疆地区的黑桑、四川地区的川桑、云南地区的奶桑分别处于不同分支。

图2 桑叶及其近缘种的系统发育树

2.2 特征图谱建立与分析

2.2.1 建立特征图谱 取31批桑叶样品，按照“2.2.2”项下方法制备31份供试品，按照“2.2.1”项下方法进样分析，记录色谱图。将得到的31份色谱图结果，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》，以S28样品的图谱为参照，生成对照图谱，共标记17个共有峰，结果见图3A；通过与对照品对比，指认出10个成分，见图3B、C，分别为峰2（新绿原酸）、峰3（绿原酸）、峰5（隐绿原酸）、峰6（芦丁）、峰8（异槲皮苷）、峰10（异绿原酸B）、峰12（紫云英苷）、峰13（异绿原酸C）、峰15（山柰酚）。

图3 31批桑叶药材及混合对照品的相关图谱

2.2.2 相似度评价与聚类分析 通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》的分析结果，可知31批桑叶药材特征图谱相似度均＞0.900，结果见表3。利用SPSS 27.0软件，以31批桑叶药材的17个共有峰峰面积为变量，进行聚类分析，见图4。31批桑叶药材共分为2类，S1~S6、S12、S26~S28为Ⅰ类，S7~S11、S13~S25、S29~S31为Ⅱ类。

图4 桑叶药材聚类

表3 桑叶药材相似度评价结果

S10.994S110.999S210.999 S60.992S160.940S260.999 S70.978S170.999S270.999编号相似度编号相似度编号相似度S20.995S120.991S220.999 S30.996S130.988S230.972 S40.995S140.973S240.980 S50.992S150.970S250.984 S80.978S180.998S280.997 S90.999S190.995S290.995 S100.999S200.978S300.998 S310.988

2.2.3 主成分分析（principal component analysis，PCA） 利用SPSS 27.0软件，以31批桑叶药材的17个共有峰峰面积为变量，导入软件进行主成分分析。共提取到5个主成分，特征值和方差贡献率见表4，可知5个成分方差贡献率总计89.745%，筛选得到的5个主成分可以反映桑叶的大部分信息。PCA得分图见图5，可知31批桑叶药材得分情况分为两类。

图5 桑叶药材主成分分析得分

表4 桑叶药材主成分特征值和方差贡献率

成分特征值方差贡献率（%）累积贡献率（%）31.6449.67075.52918.57250.42650.42622.62415.43365.85941.4148.31583.84451.0035.90189.745

2.3.4 正交偏最小二乘判别分析 采用SIMCA-P 14.1软件，进一步筛选引起产地差异的质量标志物，将17个共有峰的峰面积设定为分析变量，对31批桑叶进行正交偏最小二乘判别分析，并在此基础上构建模型，结果见图6A：模型中R2X=0.714，R2Y=0.740，Q2=0.599，R2和Q2均＞0.5，31批桑叶分成两类。

图6 OPLS-DA相关图

通过200次置换检验，进一步验证模型的有效性，结果见图6B：Q2与Y轴相交点＜0。以变量重要投影（variable importance projection，VIP）值＞1为标准，筛选得到9个成分，依次为峰3（绿原酸）、峰6（芦丁）、峰8（异槲皮苷）、峰7、峰9、峰11、峰5（隐绿原酸）、峰14和峰12（紫云英苷），可作为质量差异标志物。

3 讨论

在桑叶药材的使用中，因其形态与多个物种相似，且缺乏相关的针对性研究，使其在市场流通中易与其近缘种混淆。目前，对于桑叶的鉴定，以传统方法形状鉴别和显微鉴别为主，但这种方法基于外形进行鉴定，易受物种遗传因素、环境、鉴别人员专业程度的影响，重复性和稳定性差，且往往主观性较强[20]。相较于传统鉴别方法，DNA条形码技术是一种快速、高效的鉴定方法，不受物种形态和发育情况的影响，且ITS2序列的鉴定效果在多种植物的分子鉴定中已得到验证[11-16,21]。基于前期报道，本研究选择ITS2序列作为鉴别桑叶及其近缘种的DNA序列；结果显示，桑叶及其近缘种平均种间距离明显大于桑叶平均种内遗传距离，表示ITS2序列在两者间具有显著的变异性，且NJ树将不同物种聚在不同分支，说明基于ITS2序列能够鉴别和区分桑叶及其近缘种。凝胶电泳显示样品均存在拖尾，推测DNA存在降解，这可能是不同产地样品的加工方式和储存条件引起的，但均能测序成功，提示此现象不影响最终结果。值得注意的是，本实验中GC含量显示桑叶与其近缘种存在重叠，这与Yan等[22]对于玉竹、黄精及其近缘种的DNA鉴定结果相似，其进一步研究显示GC含量存在重叠主要是因为物种间的同源性较高，而不影响鉴定结果，且桑叶与其近缘种的遗传距离和进化树已显示两者之间存在明显的遗传差异，故GC含量仅作为体现序列组成整体特征的因素。

本实验31批桑叶的谱图相似度结果显示8个产地的桑叶质量具有较好的均一性；聚类分析与主成分分析结果均显示云南昆明和广西玉林聚为一类，其余产地聚为一类，其主要影响因素可能是地域生态环境。云南、广西地处湿热地带，气候温暖湿润，桑叶次生代谢产物积累模式相近，而安徽省、河南省、山东省、河北省等地处于中北方温带地区，气候干燥、四季分明，故产地间呈现明显聚类分化，可客观反映不同产地桑叶质量差异。此外，从单一批次的图谱观察到，已知的差异性成分绿原酸、芦丁、异槲皮苷、隐绿原酸和紫云英苷在云南昆明和广西玉林产地峰面积明显大于其他产地，提示云南昆明和广西玉林的桑叶含有的差异性成分含量更高，桑叶质量或优于其余产地。本研究未开展质量差异标志物的深入研究，差异物含量及范围有待进一步确定，同时未研究桑叶药材的药效是否与质量差异物存在明显的关联性，这可作为后续进一步研究的方向。

目前已有研究多采用单一的评价手段对桑叶药材进行质量评价，难以构建全面的评价体系[23-25]。因此本研究构建DNA鉴定和HPLC特征图谱的一体化评价体系，一方面利用ITS2序列实现桑叶及其近缘种的精准区分，弥补传统鉴别手段的不足；另一方面通过HPLC特征图谱结合化学计量学系统评价多产地的桑叶质量差异，筛选质量差异标志物，为突破单一成分评价提供思路和依据。同时，DNA条形码与HPLC特征图谱在中药材质量控制中具有良好的互补性，前者可从分子层面实现物种鉴定，保障基原真实性，后者结合化学计量学可系统评价药材质量差异，反映内在品质，二者协同作用强，联用可构建“基原鉴定+质量评价”的一体化质控体系，具有广阔的应用前景。

综上所述，本研究对桑叶药材进行DNA鉴定，并利用特征图谱联合化学计量分析，不仅能良好且直观地鉴别和区分桑叶及其近缘种，还较好地体现出不同产地的桑叶药材质量差异，为桑叶药材DNA鉴定和质量评价提供了科学参考依据。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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DNA identification and quality evaluation of Morus alba

YANG Sang1 HU Zhun2 LIU Xia1 XIONG Fuliang1

1.School of Chemistry, Chemical Engineering and Life Sciences, Wuhan University of Technology, Hubei Province,Wuhan 430070, China; 2.Li Shizhen Pharmaceutical Research Institute, Hubei Province, Ezhou 436030, China

[Abstract] Objective To establish a DNA identification method for Morus alba and its related species, and to evaluate the quality of Morus alba medicinal materials from different areas. Methods The ITS2 sequences of Morus alba and their related species were amplified and sequenced by PCR. Sequence analysis, genetic distance calculation, and phylogenetic tree construction were conducted using MEGA 11.0. A HPLC characteristic spectrum of Morus alba was established, and the quality of Morus alba medicinal materials from different origins was evaluated by using chemometrics methods. Results The average intraspecific genetic distance of Morus alba was smaller than the average interspecific genetic distance between Morus alba and its related species. The NJ tree showed that Morus alba clustered into a single clade, which could be clearly distinguished from its related species. Seventeen common peaks were identified in the characteristic chromatograms of 31 batches of Morus alba, with all similarities above 0.900, and ten components were indentified in total. Cluster analysis and principal component analysis grouped the 31 batches of Morus alba into two categories; orthogonal partial least squares discriminant analysis screened out nine differential quality maker components. Conclusion The ITS2 sequence can effectively identify and distinguish Morus alba and its related species, and the established HPLC characteristic chromatogram evaluation method is stable and reliable, which can provide a reference for the DNA identification and quality evaluation of Morus alba medicinal materials.

[Key words] Morus alba; ITS2 sequence; DNA identification; Characteristic chromatogram; Chemometric; Quality evaluation

[中图分类号] R284.1

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）07（a）-0001-09

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25120059

[基金项目] 湖北省重大科技专项（2024BCA002）；武汉东湖新技术开发区“3551光谷人才计划”项目（武新管〔2018〕46号）。

[作者简介] 杨桑（2001-），女，武汉理工大学化学化工与生命科学学院2023级药学专业在读硕士研究生；研究方向：中药质量评价。

[通讯作者] 熊富良（1967-），男，博士，教授，高级工程师，主要从事中药新药研制、药物新制剂和中药工程化研究工作。

（收稿日期：2025-12-01）

（修回日期：2026-03-03）