在当前临床诊疗实践中，乳腺癌的治疗策略主要有手术切除、化疗、放疗、靶向治疗、内分泌治疗及免疫治疗[1]。然而，化疗作为乳腺癌的主要治疗手段之一，其不良反应往往较大。本研究主要目的是筛选具有抑制肿瘤细胞增殖能力、使用剂量较低且对正常细胞无毒性作用的药物分子。

menadione即维生素K3，是一种合成的萘醌类化合物。维生素K家族成员包括天然存在的K1（叶绿醌，来源于绿色蔬菜）和K2（甲基萘醌类，由肠道细菌合成），以及人工合成的K3（甲萘醌）。维生素K的经典生理功能是作为凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ翻译后γ-羧化修饰的辅因子，参与凝血机制[2]。然而，越来越多的研究表明，维生素K家族成员——尤其是menadione具有广泛的抗肿瘤活性。menadione已被证实对多种肿瘤细胞系具有抑制作用，包括肺癌、肝癌、白血病、前列腺癌及乳腺癌等[3-7]。有研究发现，menadione可通过氧化VPS34，诱导一种名为“triaptosis”的新型细胞死亡途径[8]。在转基因前列腺癌小鼠模型中，饮用水中添加menadione（0.15 mg/ml）可明显延缓肿瘤进展达18周以上，且耐受性良好、不影响凝血功能[9]。这些发现使menadione作为一种潜在的抗肿瘤候选药物分子重新受到关注。

本研究拟选用menadione作为候选药物分子，通过对比分析乳腺癌细胞与正常乳腺细胞的存活率和生长状况，深入探究乳腺癌涉及基因调控和细胞周期调控的分子机制。本研究致力于构建一个更为完善的研究体系，为未来癌症治疗提供更为充实的理论支撑。

1 材料与方法

1.1 细胞

人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和人正常乳腺上皮细胞株MCF-10A购自中国科学院上海细胞库。细胞置于含15%胎牛血清的DMEM培养液中，在37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。根据使用说明培养和储存细胞，并在第5～20代使用。

大肠埃希菌TOP10感受态细胞（货号：CB104-03）购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 主要试剂及仪器

1.2.1 主要试剂 menadione（德国默克公司，批号：M5625）；MTT（德国默克公司，批号：M2128）、RIPA裂解缓冲液（上海碧云天生物技术股份有限公司，批号：P0013B）；Anti-p21 Antibody（英国Abcam公司，货号：ab109199）；Anti-cyclin E Antibody（美国Santa Cruz Biotechnology公司，货号：sc-247）；Anti-CDK2 Antibody（美国Santa Cruz Biotechnology公司，货号：sc-163）；Anti-β-actin Antibody（美国Santa Cruz Biotechnology公司，货号：sc-47778）；Anti-p53 Antibody（美国Santa Cruz Biotechnology公司，货号：sc-126）；Anticyclin D1 Antibody（美国Santa Cruz Biotechnology公司，货号：sc-8396）；Anti-CDK4 Antibody（美国Santa Cruz Biotechnology公司，货号：sc-23896）；Anti-cyclin D3 Antibody（美国Santa Cruz Biotechnology公司，货号：sc-6283）；Anti-Sp-1 Antibody（美国Santa Cruz Biotechnology公司，货号：sc-17824）；Anti-PARP Antibody（美国Cell Signaling Technology公司，货号：9532S）；Anti-α-tubulin Antibody（美国Sigma-Aldrich公司，货号：T5168）；HRP-Goat Anti-Rabbit IgG（上海碧云天生物技术股份有限公司，货号：A0208）；RNeasy mini试剂盒（德国Qiagen公司，货号：74104）；Power SYBR Green PCR Master Mix（美国Thermo-Fisher Scientific公司，货号：4367659）；ECL Western Blotting检测试剂盒（人IgG）（美国Millipore公司，货号：WBKLS0500）；染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）试剂盒（美国Millipore公司，货号：17-295）；CCK8（日本Dojindo公司，货号：CK04）。

1.2.2 主要仪器 EnSight™多模式酶标仪（美国PerkinElmer公司）；CKX41型光学显微镜（日本Olympus公司）；BD FACSCalibur流式细胞仪（美国BD Biosciences公司）、7500 Fast Real-Time PCR系统（美国Applied Biosystems公司）。

1.3 MTT法检测细胞存活率

将MDA-MB-231细胞和MCF-10A细胞接种至96孔板中，每孔接种1×105个细胞，并加入100 μl培养基。待细胞贴壁后，设置不同浓度的menadione（0、0.058、0.580、5.800、58.000 μmol/L）处理组[menadione浓度梯度依据前期预实验结果，并参考文献[10]的有效浓度范围]。加入不同浓度的menadione后，将其置于培养箱中培养24 h。培养结束后，吸出培养基，加入MTT溶液（0.5 mg/100 μl）继续培养4 h，直至见紫色沉淀。弃去培养基，加入150 μl DMSO，振荡10 min。使用EnSight™多模式酶标仪在595 nm处测量相对光密度值。

1.4 细胞生长动态分析

按照1×105个/孔的密度将细胞接种至6孔板中，设置不同浓度的menadione（0、0.058、0.580、5.800、58.000 μmol/L）处理组。每日更换含相应浓度的menadione新鲜培养基。使用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化细胞，采用0.5%台盼蓝染色法对细胞进行染色，使用血球计数器在光学显微镜下对存活细胞进行计数，连续处理4 d。将采集的数据录入SigmaPlot 14.0软件，绘制细胞生长曲线。

1.5 RT-qPCR法检测相关基因表达

按照2×105个/孔的密度将细胞接种于10 cm2的培养皿中，根据预实验的结果，采用不同浓度的menadione（0、0.058、0.580、5.800 μmol/L）处理细胞24 h。使用RNeasy mini试剂盒提取总RNA，Power SYBR Green PCR Master Mix将其反转录为cDNA，7500 Fast Real-Time PCR系统实施RT-qPCR反应。RT-PCR反应体系为20 μl：Power SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，正、反向引物各0.5 μl，cDNA模板2 μl，无核酸酶水补至20 μl。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环。最后进行熔解曲线分析。引入由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列见表1。

表1 引物序列（5’→3’）

基因名称引物序列产物长度（bp）p21正向引物：TTGTCGCTGTCTTGCACTCT156反向引物：ATTTCCGGTGCTGGGAATCA156 GAPDH正向引物：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT102反向引物：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG102

1.6 流式细胞术分析细胞周期

MDA-MB-231细胞培养于10 cm2的培养皿中。采用不含胎牛血清的培养液（Starvation）处理细胞24 h，更换常规培养基（含胎牛血清的培养液），以此作为0点；每隔3 h收集1次细胞样本。使用流式细胞术分析细胞周期。

将MDA-MB-231细胞培养于10 cm2培养皿中，待细胞融合度达70%左右时，吸去原培养液，更换为不含胎牛血清的DMEM培养液（Starvation）继续培养24 h，以使细胞同步化于G0/G1期。同步化结束后，收集一培养皿细胞作为对照组；其余培养皿更换为含10%胎牛血清的DMEM培养液，并分别加入浓度为0.058、0.580、5.800 μmol/L的menadione，继续处理24 h后收集细胞；使用预冷至4 ℃的PBS洗涤细胞；在950 μl预冷至4 ℃的70%乙醇中固定1 h；碘化丙啶对细胞进行染色，并在室温下避光孵育10～15 min。使用BD FAC-SCalibur流式细胞仪检测细胞周期。

1.7 Western blot法检测相关蛋白表达

细胞培养于10 cm2的培养皿中，待细胞融合度达70%左右时，吸去原培养液，更换为不含胎牛血清的培养液（Starvation）继续培养24 h，使细胞同步化。随后，分别加入浓度为0、0.058、0.580、5.800 μmol/L的menadione完全培养液处理24 h。RIPA裂解缓冲液裂解细胞，采用BCA法测定蛋白浓度；将样品与上样缓冲液混合，用于SDS-PAGE；凝胶中的蛋白使用Bio-Rad的标准湿膜转移装置转移到PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭，与相应一抗[anti-p53（1∶1 000）、anti-p21（1∶1 000）、anti-cyclin D1（1∶1 000）、anti-cyclin D3（1∶1 000）、anti-cyclin E（1∶1 000）、anti-CDK2（1∶1 000）、anti-CDK4（1∶1 000）、anti-β-actin（1∶5 000）]4 ℃孵育过夜；次日，与二抗[HRP标记的羊抗兔IgG（1∶5 000）]孵育后，使用试剂盒对PVDF膜进行化学发光检测。

1.8 细胞核与细胞质的分离及检测

取MDA-MB-231细胞培养于10 cm2培养皿中，待细胞融合度达70%左右时，采用不含胎牛血清的DMEM培养液（Starvation）处理细胞24 h，使细胞同步化。随后分别用含0、5.800 μmol/L menadione的完全培养液处理细胞24 h。收集细胞样本，并添加含蔗糖的缓冲溶液。使用Dounce匀浆器对细胞进行轻柔破碎（垂直方向操作25次，水平方向操作20次），3 000×g离心5 min（离心半径约8.5 cm），取上清液。向上清液中加入NP40，静置20 min后，14 000×g离心20 min（离心半径约8.5 cm），所得上清液即为细胞质组分。将首次离心后的沉淀物重悬于50 μl的核提取缓冲液中，静置20 min，14 000×g离心5 min（离心半径约8.5 cm），收集上清液作为核组分。上述所有操作步骤均在冰浴上操作，以保持样本处于低温状态。

采用Western blot法检测相关蛋白表达。取分离的细胞核与细胞质蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳，转膜后分别与一抗anti-Sp-1（1∶1 000）、anti-PARP（1∶1 000）及anti-α-tubulin（1∶5 000）于4 ℃孵育过夜；次日与二抗孵育后，使用试剂盒进行化学发光检测。α- tubulin作为细胞质组分内参，PARP作为细胞核组分内参。

1.9 ChIP技术

用1%甲醛和甘氨酸固定细胞，使组蛋白和非组蛋白与染色质交联。使用抗体或相应的IgG沉淀与之相关的染色质；随后，通过RT-qPCR法对特异性DNA片段进行定量；最后，利用已设计好的p21 promotor primer进行PCR反应。

PCR反应体系为25 μl：YEA Taq DNA聚合酶0.5 μl，10×Taq缓冲液2.5 μl，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μl，p21启动子特异性正、反向引物（10 μmol/L）1 μl，DNA模板2 μl，无核糖酶水补至25 μl。反应条件：首先，95 ℃预变性3 min；然后，进行35个循环，每个循环包括95 ℃变性30 s、52 ℃退火20 s、72 ℃延伸30 s；最后，72 ℃延伸7 min终止反应。取25 μl PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳（含溴化乙锭），于0.5×TBE缓冲液、100 V电压下电泳约40 min，于紫外线透射灯下观察DNA条带。

1.10 p21基因RNA干扰慢病毒载体构建

以p21基因为模板，依据RNA干扰序列设计原则，设计多个长度为19～21个核苷酸的RNA干扰靶序列。在p21基因RNA干扰慢病毒载体构建中，设计了2个特异性干扰靶点。Human-p21-1（编号：Pbr32481），靶点序列为：5’-TAAGAAAGAAGATGAGACAAT-3’；Human-p21-2（编号：Pbr32482），靶点序列为：5’-GCAGGAATAATTGCTGATGAA-3’。完成靶点设计后，合成包含选定干扰序列的单链DNA寡核苷酸（oligo），经退火处理形成双链DNA oligoduplexes。随后，利用其两端预设的酶切位点，将双链产物直接连至经相应酶切的慢病毒载体骨架中。将连接产物转化入制备好的大肠埃希菌TOP10感受态细胞中。通过菌液PCR筛选阳性重组克隆，送交测序验证。对测序结果比对确认无误的阳性克隆进行质粒提取。本研究采用的慢病毒表达载体为BR-V121质粒，其图谱见图1。为进行功能验证，设立空载体阴性对照组（sh-Ctrl组）、sh-p21-1组、sh-p21-2组。

图1 BR-V 121载体图谱

1.11 CCK8检测敲低p21后细胞增殖能力

将sh-Ctrl组、sh-p21-1组、sh-p21-2组MDA-MB-231细胞分别以1×104个/孔的密度接种于96孔板中，每组设3个复孔。待细胞贴壁后，加入含5.800 μmol/L menadione的完全培养液，分别处理24、48、72、96、120 h后，每孔加入10 μl CCK8溶液，于37 ℃培养箱中避光孵育2 h，使用EnSight™多模式酶标仪在450 nm波长处测量光密度值。

1.12 统计学方法

采用SPSS 26.0统计学软件进行数据分析，Graph-Pad Prism5软件作图。计量资料用均数±标准差（）表示。

2 结果

2.1 menadione对MDA-MB-231和MCF-10A细胞增殖能力的影响

2.1.1 对细胞存活率的影响 在MDA-MB-231细胞中，与0 μmol/L比较，5.800、58.000 μmol/L细胞存活率降低；在MCF-10A细胞中，与0 μmol/L比较，58.000 μmol/L细胞存活率降低。见图2。

图2 不同浓度的menadione对细胞存活率的影响（n=3）

2.1.2 对细胞生长的影响 在MDA-MB-231细胞中，从处理第2天起5.800 μmol/L的细胞生长受到抑制，且随时间延长抑制效应逐渐增强；58.000 μmol/L的细胞增殖完全被抑制。在MCF-10A细胞中，58.000 μmol/L的细胞增殖完全被抑制。见图3。

图3 不同浓度的menadione对细胞生长的影响（n=3）

2.2 menadione对MDA-MB-231和MCF-10A细胞p21 mRNA表达的影响

在MDA-MB-231细胞中，与0 μmol/L比较，5.800 μmol/L的p21 mRNA表达升高；在MCF-10A细胞中，0.058、0.580、5.800 μmol/L的p21 mRNA表达情况与0 μmol/L相似。见图4。

图4 不同浓度的menadione对细胞p21 mRNA表达的影响（n=3）

2.3 menadione对MDA-MB-231和MCF-10A细胞p21、p53蛋白表达的影响

在MDA-MB-231细胞中，与0 μmol/L比较，5.800 μmol/L的p21蛋白表达升高；在MCF-10A细胞中，0.058、0.580、5.800 μmol/L的p21、p53蛋白表达情况与0 μmol/L相似。见图5。

图5 不同浓度的menadione对细胞p21、p53蛋白表达的影响（n=3）

2.4 MDA-MB-231细胞周期的建立

MDA-MB-231细胞0点时G0/G1期细胞比例为（75.6±3.2）%，S期为（14.8±2.1）%，G2/M期为（9.6±1.5）%。更换培养液后，G0/G1期细胞比例随时间的延长逐渐降低，第24小时降至最低值（42.3±2.8）%；G2/M期细胞比例随时间的延长逐渐升高，第24小时升至峰值（32.5±2.9）%。S期细胞比例在12～18 h达到峰值，随后逐渐下降。

2.5 menadione对MDA-MB-231细胞周期分布的影响

与0 μmol/L比较，5.800 μmol/L的G0/G1期细胞比例升高，S期和G2/M期细胞比例降低。见图6。

图6 不同浓度的menadione对细胞周期分布的影响（n=3）

2.6 menadione对MDA-MB-231细胞周期相关蛋白表 达的影响

与0 μmol/L比较，5.800 μmol/L的cyclin E和CDK2蛋白表达降低。见图7。

图7 不同浓度的menadione对细胞周期相关蛋白表达的影响（n=3）

2.7 menadione对MDA-MB-231细胞核质分布的影响

在细胞核中，5.800 μmol/L的Sp-1、PARP蛋白表达情况与0 μmol/L相似。见图8。

图8 menadione对MDA-MB-231细胞转录因子核质分布的影响（n=3）

2.8 敲低p21后menadione对MDA-MB-231细胞增殖能力的影响

与sh-Ctrl组比较，sh-p21-1组和sh-p21-2组细胞增殖能力升高。见图9。

图9 敲低p21对menadione抑制细胞增殖能力的影响（n=3）

3 讨论

menadione展现出抗癌特性，能够有效抑制多种肿瘤细胞，包括细支气管肺泡癌、肝癌细胞、白血病和乳腺癌细胞[11-14]。本研究结果显示，menadione对MDA-MB-231细胞具有抑制效果，甚至在5.800 μmol/L的低剂量下也显示出明显效果；而MCF-10A细胞在低剂量下变化不大，但在高剂量下同样会完全受到抑制。menadione对细胞生长具有一定的影响；长期处理细胞会导致细胞毒性，进而影响细胞生长。

细胞生长受细胞周期调控，而细胞周期则由细胞周期蛋白及激酶发挥作用[15-17]。p21基因为细胞周期蛋白激酶抑制剂，本研究结果显示，与0 μmol/L比较，5.800 μmol/L的p21 mRNA和蛋白表达升高，而p53蛋白表达量未见变化；与0 μmol/L比较，5.8 μmol/L的G0/G1期细胞比例升高，S期和G2/M期细胞比例降低；与0 μmol/L比较，5.800 μmol/L的cyclin E和CDK2蛋白表达降低。menadione能够诱导MDA-MB-231细胞p21mRNA的表达，上调p21蛋白表达，抑制CDK的表达，导致细胞周期停滞，从而抑制细胞生长[18-21]。p21敲低后，MDA-MB-231细胞增殖能力增加，进一步验证menadione能够抑制细胞周期，从而抑制细胞生长。综上所述，menadione通过p21依赖性途径抑制周期进展。

p21基因表达分为p53依赖型和非依赖型，但由于MDA-MB-231细胞是p53突变型，因此p53的作用无法调控p21基因的表达[22-23]。另外，由于p21基因上游存在Sp-1结合位点，位于启动子-119/+16之间，因此优先考虑这一转录因子。本研究结果显示，5.800 μmol/L的细胞Sp-1、PARP蛋白表达情况与0 μmol/L相似。可能是因为5.8 μmol/L处理细胞不足以引发Sp-1转录因子去调节p21基因表达，而是由其他转录因子进行调控。

本研究存在一定的局限性：本研究未明确上游转录因子，未来需要进一步开展组学筛查（如RNA-seq或ChIP-seq），研究p21基因表达的上游调控分子。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Effect of menadione on the growth of human breast cancer cells

LIU Zhiyong CHEN Ran

Breast Treatment Center, the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University, Jiangxi Province, Ganzhou 341000, China

[Abstract] Objective To study the effect of menadione on the growth of human breast cancer cells. Methods Human breast cancer cell line MDA-MB-231 was treated with different concentrations of menadione (0, 0.058, 0.580,5.800 μmol/L, and 58.000 μmol/L), and the effect on the cell proliferation ability was observed; the expressions of related gene were detected by RT-qPCR, and the expressions of related protein were detected by Western blot; and the effect of menadione on the cell cycle distribution of cells was observed. The nucleus and cytoplasm were isolated to observe the effect of menadione on the nuclear and cytoplasmic distribution of cells. After knocking down p21, cells were divided into sh-Ctrl group, sh-p21-1 group, and sh-p21-2 group, and the effect on cell proliferation ability was observed by CCK8 method. Results Compared with 0 μmol/L, the cell survival rates at 5.800 and 58.000 μmol/L decreased. Compared with 0 μmol/L, the expressions of p21 mRNA and protein at 5.800 μmol/L increased, while the expressions of cyclin E and CDK2 protein decreased. Compared with 0 μmol/L, the proportion of cells in the G0/G1 phase at 5.800 μmol/L increased, while the proportions of cells in the S phase and G2/M phase decreased. The expressions of Sp-1 and PARP protein at 5.800 μmol/L was similar to that at 0 μmol/L. Compared with the sh-Ctrl group, the cell proliferation ability of the sh-p21-1 group and the sh-p21-2 group increased. Conclusion Menadione can effectively inhibit the growth of human breast cancer cells.

[Key words] Menadione; Breast cancer; Cell cycle; Cell apoptosis

[中图分类号] R737.9

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）07（b）-0039-07

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25061766

[基金项目] 国家自然科学基金资助项目（82460495）。

[作者简介] 刘志勇（1982-），男，硕士，副主任医师，副教授，主要从事乳腺外科临床研究工作。

（收稿日期：2025-06-26）

（修回日期：2026-03-05）