骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）是造血干细胞异常克隆性髓系肿瘤，以骨髓发育不良、无效造血、顽固性血细胞减少为核心特征，易进展为造血功能衰竭或急性髓系白血病[1]。该病的病程、症状及预后异质性显著，需个体化治疗[2]。造血干细胞移植是目前唯一可能治愈的手段，但受诸多条件限制[3]；支持治疗虽能改善贫血、提升生活质量，却无法延缓疾病进程，长期输血还可能引发铁过载，加重器官负担并降低治疗耐受性[4]。

中医药在MDS防治中凸显多靶点干预、个体化方案及全程动态管理的独特优势。本研究团队基于多年临床经验研制的益髓颗粒，由炙黄芪、党参、阿胶等中药组成，以益气养阴活血为核心治法，临床疗效确切[5]。益髓颗粒虽已应用于临床，但其核心作用机制尚未明确，此前也未采用斑马鱼模型探究益髓颗粒对MDS的干预作用。本研究拟构建属于人源肿瘤异种移植中的斑马鱼模型。斑马鱼因胚胎透明便于活体观察、发育周期短、适合大规模研究等特点，成为造血系统疾病理想模式生物[6-7]。本研究旨在通过斑马鱼模型探索益髓颗粒干预MDS的疗效，为MDS研究提供新型动物模型支撑，也为益髓颗粒核心机制研究提供实验基础。

1 对象与方法

1.1 实验动物

本研究采用杭州环特生物科技股份有限公司提供的AB系野生型斑马鱼[实验动物生产许可证号：SCXK（浙）2022-0003，实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2022-0004]，饲养条件符合国际实验动物评估与认证协会认证标准（编号：001458），并通过杭州环特生物科技股份有限公司实验动物管理与使用委员会批准（IACUC-2024-10808-01）。

斑马鱼饲养于28 ℃定制水环境中，水质参数：反渗透水添加200 mg/L速溶海盐，电导率450～550 μS/cm，pH 6.5～8.5，硬度50～100 mg/L CaCO3，光照周期为14 h/10 h光照/黑暗交替，实验动物饲养设施合格证号：SYXK（浙）2022-0004。斑马鱼以自然成对方式交配进行胚胎繁殖。

1.2 人源MDS肿瘤细胞

本研究所用人MDS细胞系MDS-L（Cellosaurus ID：CVCL_A8QV）购自合肥万物生物科技有限公司（货号：Delf-24664），使用MDS-L专用培养基，37 ℃、5% CO2条件下培养。

1.3 研究药物及配置

益髓颗粒，处方组成为炙黄芪、党参、生地黄、熟地黄、阿胶、龟板胶等，由北京中医药大学东直门医院提供（批号：京药制字Z20053081）；注射用阿扎胞苷（批号：231024127，正大天晴药业集团股份有限公司）。

益髓颗粒用超纯水配制成20.0 mg/ml母液，振荡并超声5 min；阿扎胞苷用超纯水配制成10.0 mg/ml母液，振荡并超声5 min。现配现用。

1.4 主要试剂与仪器

甲基纤维素（批号：J16IS217502，上海源叶生物科技有限公司）；MDS-L专用培养基（批号：2024122601，合肥万物生物科技有限公司）；CM-DiI[批号：2335589，赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；磷酸盐缓冲液（干粉）（批号：24002553，北京兰杰柯科技有限公司）。

解剖显微镜（型号：SZX7，日本奥林巴斯株式会社）；精密电子天平[型号：CP214，奥豪斯仪器（上海）有限公司，称量精度：0.000 1 g]；CCD相机（型号：VertA1，上海土森视觉科技有限公司）；显微注射仪（型号：IM300，美国史密斯-鲁特公司）；拉针仪[型号：PC-10，玉崎科学仪器（深圳）有限公司]；电动聚焦连续变倍荧光显微镜（型号：AZ100，日本尼康株式会社）；CO2培养箱[型号：3111，赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；双人单面净化工作台（型号：SW-CJ-215KS，上海苏净实业有限公司）；倒置显微镜（型号：CKX53，日本奥林巴斯株式会社）；低速离心机[型号：TD5A，赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；超声波清洗机（型号：JP-010T，深圳市洁盟清洗设备有限公司）。

1.5 造模方法与药效学评价

在显微镜下筛选发育一致的受精后2 d（2 day post fertilization，2 dpf）的AB系野生型斑马鱼胚胎，通过显微注射技术将CM-DiI标记的MDS-L细胞约200个/尾移植至斑马鱼卵黄囊区域，构建MDS斑马鱼模型。分别在细胞注射时（0 h）和5 dpf（实验终点）采用荧光显微镜观察阳性区域荧光面积，并通过定量分析荧光信号面积评估MDS细胞在斑马鱼体内的存活情况。在实验终点观察肿瘤细胞存活情况，CM-DiI标记后肿瘤细胞呈红色荧光，证明模型构建成功。

1.6 益髓颗粒给药浓度测定

CM-DiI标记的MDS-L细胞约200个/尾移植至斑马鱼卵黄囊区域，将3 dpf的斑马鱼在显微镜下筛选肿瘤细胞分布均匀的个体，移至6孔板（30尾/孔）中。实验组予水溶性益髓颗粒，浓度分别为125、250、500、1 000、2 000 μg/ml；模型对照组给予标准稀释水（3 ml/孔）。两组均在35 ℃下处理2 d，统计两组斑马鱼的死亡情况，测定益髓颗粒抗肿瘤功效最大检测浓度。根据益髓颗粒对斑马鱼的最大检测浓度确定后续药效学评价研究给药浓度。

1.7 益髓颗粒的抗肿瘤功效

造模成功的斑马鱼胚胎分为模型对照组、不同浓度阿扎胞苷（125、250、500 μg/ml）组、不同浓度益髓颗粒（125、250、500 μg/ml）组，在3～5 dpf给药，1次/d。每组在显微镜下挑选肿瘤细胞一致性较好的斑马鱼，随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照记录药物处理前后斑马鱼胚胎体内的荧光面积变化，分析MDS-L细胞荧光强度，评价益髓颗粒的抗肿瘤功效。

1.8 统计学方法

采用SPSS 26.0统计学软件进行数据分析，NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件采集数据，GraphPad Prism 9.0 软件作图。计量资料用均数±标准差（）表示，比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MDS-L细胞来源的斑马鱼模型验证

荧光显微镜显示，实验终点斑马鱼体内可见荧光信号，见图1。定量分析结果显示，MDS-L细胞荧光强度（像素）为（522 528.41±157 961.71），MDS-L细胞在斑马鱼宿主体内存活良好，实验终点未出现死亡情况。本研究成功建立MDS-L细胞来源的斑马鱼异种移植模型。

图1 斑马鱼体内MDS-L细胞荧光强度

2.2 益髓颗粒给药浓度的确定

模型对照组斑马鱼存活率为100%。实验组中益髓颗粒在125～500 μg/ml浓度范围内，斑马鱼存活状态良好，形态和行为未出现明显异常；1 000 μg/ml时，斑马鱼死亡率达17%；2 000 μg/ml时，斑马鱼全部死亡。由此确定益髓颗粒对斑马鱼的最大安全浓度为500 μg/ml。

2.3 益髓颗粒对斑马鱼体内MDS-L细胞的抑制作用

与模型对照组比较，125、250、500 μg/ml阿扎胞苷组和益髓颗粒组斑马鱼体内MDS-L细胞荧光强度降低（P＜0.05）。见图2、图3。

图2 药物干预后斑马鱼体内MDS-L细胞荧光强度

图3 各组斑马鱼体内MDS-L细胞荧光强度比较

3 讨论

MDS的诊断是基于骨髓穿刺活检病理发现形态学异常，辅以染色体核型分析、荧光原位杂交技术、流式细胞术等协助完善诊断。目前，国际上较公认的用于MDS风险分层的方法是修订的国际预后评分系统[8]。依据评分系统，临床诊疗指南上较低危组治疗目标是改善造血功能、提高生活质量；但是相应的治疗方法只能对症支持，治疗靶点单一，而较高危组化疗、长期输血不良反应明显[2]。因此，针对MDS的优势治疗目前仍在探索之中。

由于MDS患者具有高度异质性，临床前研究无法区分病情变化的潜在诱因。因此，构建人源肿瘤异种移植模型进行实验是首选方式，是临床试验和药效学验证的理想模型[9]。本研究所用MDS-L细胞系参考文献[10-11]，其组织来源于一例52岁亚裔日本男性MDS患者。目前，MDS动物模型多用小鼠、大鼠、斑马鱼等。小鼠模型在MDS研究中占主流地位，不仅可以利用基因编辑技术建立模型模拟MDS的造血特征[12]；还可以通过转致病基因构建模型[13]。而在斑马鱼中已发现多种可调节哺乳动物红细胞生成的基因，参与造血干细胞分化和成熟的转录因子和主要信号通路也高度相似[14-15]。斑马鱼模型主要通过化学诱变和基因编辑进行构建[16-17]。既往研究显示，MDS斑马鱼模型既能揭示相关基因突变通过影响细胞周期调节、血红蛋白代谢及增加启动子甲基化等推动MDS的发展，又能用于新型药物治疗MDS的机制探索[18-19]。基于此，本研究选择构建MDS-L细胞来源的斑马鱼模型，并通过定量荧光区域的面积测量肿瘤负荷，以药效学检测的方式分析益髓颗粒干预的效果[20-21]。本研究结果显示，MDS-L细胞在斑马鱼体内存活良好，模型构建成功；同时，药效学研究结果显示，益髓颗粒能够有效干预MDS-L细胞的生长。

阿扎胞苷属于第一代去甲基化药物，是首个被批准用于MDS治疗的药物，也是中高危MDS患者治疗的一线用药[22]。异常的DNA甲基化激活原癌基因和抑制肿瘤抑制基因刺激疾病发展，而含有氮杂核糖片段的核苷作为核苷胞苷的嘧啶类似物，在较低剂量使用时，可作为有效的DNA甲基化抑制剂[23-24]。阿扎胞苷的作用靶点较为明确，通过抑制甲基转移酶使DNA低甲基化，修复正常细胞的生长与分化[25]。本研究以阿扎胞苷为阳性对照组，并设置药物浓度梯度进行干预，以进一步评价斑马鱼模型用于药效评价的敏感性，结果显示，阿扎胞苷对MDS-L细胞有明显的杀伤作用，提示本模型用于药物评价的可行性。

MDS的中医病名为髓毒劳，基本病机为“正虚邪实，虚实夹杂”，以脾虚、肾亏为本，气血阴阳亏虚为先，瘀血阻络为标，邪毒内侵，致脏腑功能失调，气血阻滞，内生痰瘀，终致虚实夹杂，髓枯精绝，气血衰败而亡，或邪气峻猛攻伐而转为急劳[26]。本团队依据其病位、病性、病状将MDS创新命名为“髓毒劳”，同时针对根本病机，在“益气养阴活血”治疗大法的指导下创立益髓颗粒[27]。前期临床研究显示，益髓颗粒在缓解MDS患者临床症状，提升外周血象，改善患者生存质量，降低转白率，延长生存期等方面疗效明确[5,28]。既往相关机制研究显示，益髓颗粒能够阻滞患者外周血细胞的生长周期[29]；同时，益髓颗粒能够调节模型小鼠的免疫功能，延长荷瘤小鼠的生存期[30]。益髓颗粒可能通过调控DNA甲基化和Wnt/β-catenin信号通路治疗MDS[31]。益髓颗粒治疗MDS的作用机制是多靶点的，这可能是药效学评价中益髓颗粒组结果表现优于阿扎胞苷，且随药物浓度升高抑制效果明显的原因。然而，目前仍缺乏相应的基础研究，后续将进一步增加与MDS病理特征相关的药效指标，如造血标志物表达、细胞分化及凋亡检测等，应用本模型进行机制探索，推动MDS的中西医结合诊治。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Construction of a zebrafish model of human-derived myelodysplastic syndrome tumor cells and intervention study of Yisui Granules

ZHANG Dingdan HE Yifan WANG Jing HOU Li FAN Qiuyue CHEN Xinyi ZHANG Yu TIAN Shaodan

Department of Hematology and Oncology, Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China

[Abstract] Objective To establish a zebrafish model of human-derived myelodysplastic syndromes (MDS) tumor cells and evaluate the efficacy of Yisui Granules in treating MDS. Methods Zebrafish embryos at 2 day post fertilization(2 dpf) were taken. CM-DiI-labeled MDS-L cells were transplanted into the zebrafish yolk sac area by microinjection technique to construct the MDS zebrafish model. The successfully modeled zebrafish models were divided into model control group (standard dilution water), different concentrations of Azacitidine (125, 250, 500 μg/ml) groups, and different concentrations of Yisui Granules (125, 250, 500 μg/ml) groups. The drugs were administered at 3-5 dpf once a day. The fluorescence intensity of MDS-L cells were analyzed and the anti-tumor efficacy of Yisui Granules were evaluated. Results MDS-L cells can survive in zebrafish. Compared with the model control group, the fluorescence intensity of MDS-L cells in zebrafish in the 125, 250 μg/ml, and 500 μg/ml Azacitidine groups and the Yisei Granules groups decreased (P＜0.05). Conclusion This study successfully constructed a zebrafish model of human-derived tumor cells. Yisui Granules can inhibit the proliferation of MDS-L cells in zebrafish.

[Key words] Myelodysplastic syndrome; Zebrafish; Yisui Granules

[中图分类号] R259

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）07（b）-0046-05

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25092001

[基金项目] 国家中医药管理局高水平中医药重点学科建设项目—中医血液病学（ZYYZDXK-2023268）；中央高水平中医医院临床科研业务费资助—北京中医药大学东直门医院临床研究和成果转化能力提升试点项目（DZMG-ZJXY-23014）；北京中医药大学“揭榜挂帅”重点项目（2024-JYB-JBZD-007）。

[作者简介] 张丁丹（1998.5-），女，北京中医药大学第一临床医学院2024级中西医结合临床专业在读博士研究生；研究方向：中西医结合防治血液病及恶性肿瘤。

[通讯作者] 田劭丹（1977.12-），女，博士，教授，主任医师；研究方向：中西医结合防治血液病及恶性肿瘤与化疗后不良反应。

（收稿日期：2025-09-25）

（修回日期：2026-02-05）