急进高原所致的中枢神经系统疾病，轻则头痛、眩晕，重则发展为高致死率的高原脑水肿，危害显著，严重威胁急进人群健康[1-2]。海马组织对缺氧高度敏感，其损伤是急性高原缺氧性脑损伤（acute high-altitude hypoxic brain injury，AHHBI）致认知功能障碍的主要原因[3]。研究表明，铁死亡以铁蓄积和脂质过氧化为特征，参与AHHBI神经元损伤[4]。PI3K-Akt信号通路是调控铁死亡的关键节点，激活该通路可抑制铁死亡，而抑制则导致铁死亡发生，这表明该通路可能是干预AHHBI铁死亡的重要靶点[5-6]。常规治疗手段存在一定的局限性，而中医药凭借多靶点、整体调节的优势，在神经保护领域展现出潜力。补阳还五汤作为治疗心脑血管疾病的经典方剂，前期研究表明其可通过PI3K-Akt信号通路减轻AHHBI神经元损伤，且在脑缺血模型中可上调抗铁死亡蛋白GPX4表达[7-8]；但该方是否通过PI3K-Akt信号通路调控AHHBI海马铁死亡尚不明确。因此，本研究整合网络药理学与动物实验，系统阐明补阳还五汤是否通过调节PI3K-Akt信号轴抑制海马组织铁死亡，以期为临床提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 方药活性成分及对应靶点

补阳还五汤活性成分经中药系统药理学数据库与分析平台（https：//tcmsp-e.com/tcmsp.php）筛选（口服生物利用度 ≥30%，类药性 ≥0.18[9]）；地龙成分整合HERB数据库（http：//herb.ac.cn）及文献，经SWISSADME（http：//www.swissadme.ch）筛选（胃肠道吸收好，具Lipinski规则及血-脑屏障透过性）[10]。所有成分靶点由SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch）预测后，经R 4.5.1软件及UniProt（https：//www.uniprot.org）去重标准化构建成分-靶点集。

1.2 疾病靶点和铁死亡相关靶点

以“Acute High-altitude Hypoxia-induced Brain Injury、Acute Mountain Sickness、High Altitude Headache、High Altitude Cerebral Edema”为关键词在OMIM数据库（https：//omim.org/）和GeneCards数据库（https：//www.genecards.org）获取疾病靶点；从FerrDb数据库（http：//www.zhounan.org/ferrdb/current/）及GeneCards数据库获取铁死亡靶点。利用R 4.5.1包及UniProt数据库标准化去重后，分别构建疾病与铁死亡靶点库。

1.3 “药物-疾病-铁死亡”维恩图、蛋白质-蛋白质相互作用与“药物-成分-靶点”网络图

利用R 4.5.1软件的VennDiagram包绘制维恩图，获得补阳还五汤调控AHHBI铁死亡的潜在靶点。将交集靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org）获取蛋白质-蛋白质相互作用数据。采用Cytoscape构建蛋白质-蛋白质相互作用及“药物-成分-靶点”网络，基于Degree值筛选前5位有效成分；经cytoNCA拓扑分析确定前5位的核心靶点。

1.4 功能富集图与通路分析

将交集靶点导入Metascape数据库（https：//metascape.org/），以“Homo sapiens”为背景进行基因本体（gene ontology，GO）和京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析（筛选标准：校正后P＜0.05），提取与铁死亡密切相关的条目（生物过程、分子功能、细胞组分及信号通路），并使用R 4.5.1软件绘制富集结果图。

1.5 分子对接

基于网络分析结果，选取Degree值排名前5位的有效成分与核心靶点进行分子对接。靶点蛋白结构自PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）获取，经PyMOL去除溶剂及小分子；配体结构自PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载，经Chem3D能量优化。采用AutoDock加氢并转换为PDBQT格式后，以AutoDock Vina进行对接，生成20个构象并选取结合自由能最低者，经PyMOL可视化展示其结合模式。

1.6 体内实验

1.6.1 实验动物与主要试剂器材 54只7～8周龄SPF级C57BL/6J雄性小鼠（体质量20～25 g），购自北京维通利华实验动物技术有限公司[实验动物生产许可证号：SYXK（京）2021-0006，实验动物合格证号：110011241103735146]，饲养于青海大学医学院实验动物中心[实验动物使用许可证号：SYXK（青）2021-0002]。本研究经青海大学科技伦理委员会审查通过（PJ202401-24）。

地塞米松（货号：HY-14648）购自美国MedChemExpress公司；谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）（货号：E-EL-0026、E-EL-0060）均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份公司；β-actin、p-PI3K、SLC7A11、HRP-conjugated Goat anti-Mouse IgG（H+L）、HRP-conjugated Goat anti-Rabbit IgG（H+L）（货号：AC026、AF4372、A2413、AS003、AS014）均购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；Akt、p-Akt、PI3K、ACSL4、GPX4（货号：10176-2-AP、28731-1-AP、60225-1-Ig、22401-1-AP、67763-1-Ig）均购自美国protein tech公司；亚铁离子试剂盒（货号：BC5415）购自北京索莱宝科技有限公司；酶标仪（型号：SpectraMAXPlus384）购自美国美谷分子仪器有限公司；高速低温组织研磨（型号：KZ-III-F）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；全自动化学发光图像分析系统（型号：5200Multi）购自上海天能科技有限公司。

1.6.2 药物制备 补阳还五汤[生黄芪∶当归尾∶赤芍∶川芎∶地龙∶桃仁∶红花=120.0∶6.0∶4.5∶3.0∶3.0∶3.0∶3.0（单位：g）]，所有药材均购自青海省中医院中药房，经青海省中医院主管中药师依据《中华人民共和国药典》（2020年版）相关标准鉴定为正品。按照既往文献药物制备，加5倍量纯水浸泡1 h，武火煮沸后改文火煎煮1.5 h，滤过[11]；药渣加3倍量水复煎1次，合并两次煎液，文火浓缩，于60 ℃水浴浓缩至2 g/ml，经高压灭菌后分装，4 ℃保存备用。地塞米松以生理盐水配制成4 mg/kg，4 ℃保存，使用前恢复至室温[12]。

1.6.3 分组、给药及模型制备 将54只实验小鼠适应性饲养1 d后，采用随机数字表法分为正常对照组，低氧模型组，补阳还五汤低、中、高剂量组，地塞米松组，每组9只。根据既往文献，补阳还五汤低、中、高剂量组分别以9.26、18.53、37.06 g/kg的浓度灌胃[11]；地塞米松组给予4 mg/kg的浓度灌胃[12]；正常对照组和低氧模型组给予生理盐水。所有干预均按0.1 ml/10 g体积每日1次。给药4 d后根据前期研究造模方法，除正常对照组外，其余各组置于模拟海拔6 000 m低压氧舱持续3 d复制AHHBI模型[7]。参照文献[4]，以海马组织Fe2+含量升高、血清GSH水平降低作为AHHBI小鼠铁死亡模型成功的判定标准。期间动物自由饮水、进食，各组每天固定时间灌胃1次。

1.6.4 标本采集 造模结束后，采用乌拉坦（10%水溶液，1.2 g/kg诱导，0.36 g/kg维持）麻醉小鼠，采血后脱颈处死，冰上分离海马组织，预冷生理盐水冲洗，-80 ℃冻存备用。其中，3只用于Fe2+测定，3只用于Western blot法检测，3只用于RT-qPCR法检测。

1.6.5 血清指标的测定 血样室温静置30 min，4 ℃，3 000 r/min（离心半径10 cm）离心15 min，收集血清，-80 ℃冻存。每组血清样本初始9份，排除溶血或血量不足者，最终8份用于酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。按试剂盒说明书检测血清GSH和MDA水平。

1.6.6 Fe2+含量的测定 取组织匀浆上清，分别设置测定管、标准管和空白管，对应加入样本、标准品或蒸馏水200 μl及试剂1 100 μl，37 ℃反应10 min。测定管经氯仿萃取后在常温12 400 r/min（离心半径7 cm）下离心10 min，取上清液于593 nm处测定光密度值，计算Fe2+含量。

1.6.7 海马组织中凋亡及信号通路关键蛋白的测定 提取海马组织总蛋白，经SDS-PAGE分离后转至PVDF膜，封闭后分别加入Akt（1∶1 000）、p-Akt（1∶2 000）、PI3K（1∶5 000）、p-PI3K（1∶1 000）、ACSL4（1∶3 000）、GPX4（1∶2 000）、SLC7A11（1∶1 000）及β-actin（1∶50 000）一抗，4 ℃孵育过夜；洗膜后加入HRP标记二抗（1∶8 000）室温孵育1 h，ECL显影并计算蛋白相对表达量。

1.6.8 RT-qPCR法检测海马组织铁死亡相关mRNA 采用TRIzol法提取总海马组织RNA，反转录合成cDNA，通过TB Green法进行RT-qPCR法检测。以SYBR Green为荧光染料，β-actin为内参。RT-qPCR反应体系（20 μl）：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10.0 μl，正反向引物（10 μmol/L）各0.8 μl，cDNA 2.0 μl，ddH2O补足至20 μl。反应条件：95 ℃预变性30 s；40个循环（95 ℃变性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，采集荧光10 s）。采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物及碱基序列

基因名称引物序列（5’→3’）产物长度（bp）β-actin正向引物：CTACCTCATGAAGATCCTGACC90反向引物：CACAGCTTCTCTTTGATGTCAC GPX4正向引物：GCAGGAGCCAGGAAGTAATCAAG110反向引物：ACAGTGGGTGGGCATCGTC ACSL4正向引物：CAATAGAGCAGAGTACCCTGAG146反向引物：TAGAACCACTGGTGTACATGAC SLC7A11正向引物：CTATTTTACCACCATCAGTGCG102反向引物：ATCGGGACTGCTAATGAGAATC

1.7 统计学方法

采用SPSS 28.0统计学软件进行数据分析，Graph-Pad Prism 10.1.2作柱状统计图。计量资料采用均数±标准差（）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，若方差齐，两两比较采用LSD-t检验；若方差不齐，则采用Tamhane’s T2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 复方有效成分、疾病及铁死亡相应靶点的预测

补阳还五汤共筛选出活性成分105个，去重后得到有效成分56个，对应靶点245个。疾病相关靶点996个，铁死亡相关靶点1 582个。取三者交集获得共同靶点29个（图1A）；经Cytoscape构建“药物-成分-靶点”网络图（图1B）。拓扑学分析并按Degree值排序，排名前5位的核心活性成分为槲皮素、木犀草素、山柰酚、异鼠李素和β-谷甾醇（表2）。

图1 复方有效成分、疾病及铁死亡相应靶点的预测结果

表2 排名前5位的核心成分

IDDegree值核心成分来源药物MOL00009823槲皮素红花、黄芪MOL00000615木犀草素红花MOL00042212山柰酚红花、黄芪MOL0003548异鼠李素黄芪MOL0003587β-谷甾醇当归、赤芍、红花、桃仁

2.2 蛋白质-蛋白质相互作用网络图及关键靶点

利用Cytoscape3.9.1获得蛋白质-蛋白质相互作用网络图（图2），经cytoNCA拓扑分析与布局优化，筛选出核心靶点：TP53、TNF、IL-6、Akt1和HIF-1α，见表3。

图2 蛋白质-蛋白质相互作用网络

表3 关键靶点的拓扑学信息

排名名称Degree值中介性1TP532850.292TNF2622.853IL-62512.524Akt12515.545HIF-1α248.27

2.3 GO、KEGG生物学功能分析

对29个核心靶点进行富集分析，共获得GO条目2 112个（生物过程1 922个、细胞组分34个、分子功能156个），主要涉及信号转导、代谢调控及应激反应等相关过程；KEGG通路153条显著富集，前20条主要涉及HIF-1、TNF、活性氧、PI3K-Akt及FoxO等信号通路（图3、图4）。

图3 基因本体结果

图4 京都基因和基因组数据库结果

2.4 分子对接

结果显示，核心成分与关键靶点结合能均 ≤-5.0 kcal/mol（图5）；Akt1-槲皮素、TP53-木犀草素、TNF-山柰酚、HIF-1α-异鼠李素结合能 ≤-7.0 kcal/mol，对接三维结构见图6。此外，各核心成分亦与GPX4有效结合。在所有靶点中，核心成分与Akt1的结合能均值最低，显示其对Akt1具有最佳亲和力。

图5 最低结合能热图

图6 最佳分子对接结果

2.5 体内实验

2.5.1 各组小鼠血清指标的变化 与正常对照组比较，低氧模型组血清GSH水平降低、MDA水平升高（P＜0.05）。与低氧模型组比较，补阳还五汤中、高剂量组血清GSH水平升高、MDA水平降低（P＜0.05）。见图7。

图7 各组小鼠血清指标的变化（n=8）

2.5.2 各组小鼠海马组织Fe2+的变化 与正常对照组比较，低氧模型组海马组织中Fe2+含量升高（P＜0.05）。与低氧模型组比较，补阳还五汤各剂量组海马组织Fe2+均有不同程度的降低（P＜0.05）。见图8。

图8 各组小鼠海马组织Fe2+的变化（n=3）

2.5.3 各组小鼠海马组织铁死亡相关蛋白及基因表达的变化 与正常对照组比较，低氧模型组海马组织中ACSL4蛋白及mRNA表达均升高（P＜0.05），GPX4和SLC7A11的蛋白及mRNA表达均降低（P＜0.05）。与低氧模型组比较，补阳还五汤低剂量组海马组织SLC7A11蛋白表达升高（P＜0.05），补阳还五汤中剂量组海马组织ACSL4蛋白及mRNA表达降低（P＜0.05）、SLC7A11蛋白表达升高（P＜0.05），补阳还五汤高剂量组海马组织ACSL4蛋白及mRNA表达降低（P＜0.05）、GPX4与SLC7A11的蛋白及mRNA表达均升高（P＜0.05）。与补阳还五汤低剂量组比较，补阳还五汤中剂量组海马组织SLC7A11蛋白表达升高（P＜0.05），补阳还五汤高剂量组海马组织ACSL4蛋白表达较低（P＜0.05）、GPX4与SLC7A11蛋白表达升高（P＜0.05），GPX4 mRNA表达升高（P＜0.05）。与补阳还五汤中剂量组比较，补阳还五汤高剂量组海马组织GPX4 mRNA表达升高。见图9。

图9 各组小鼠海马组织铁死亡相关蛋白及基因表达的变化（n=3）

2.5.4 各组小鼠海马组织通路关键蛋白的变化 与正常对照组比较，低氧模型组海马组织p-Akt/Akt蛋白比值降低（P＜0.05）。与低氧模型组比较，补阳还五汤各剂量组海马组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白比值均升高（P＜0.05）。与补阳还五汤低剂量组比较，补阳还五汤高剂量组海马组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白比值升高（P＜0.05）。见图10。

图10 各组小鼠海马组织通路关键蛋白的变化（n=3）

3 讨论

根据中医辨证，AHHBI属本虚标实之证[13]。高原清气稀薄，宗气生化乏源，推动无力，血行滞缓，瘀阻脑络，髓海失养，而成本虚标实之“气虚血瘀”证。清代王清任所创补阳还五汤针对此证，功在补气活血。现代研究表明，“气虚”“血瘀”与氧化应激及能量代谢紊乱密切相关[14]。高原低氧促使活性氧蓄积，在上述病理基础上可诱导铁死亡，引发AHHBI[4]。PI3K-Akt信号通路作为调控能量代谢与细胞存活的关键信号通路，通路上相关因子活性降低可致线粒体功能障碍、葡萄糖利用受阻，可视为“气虚”状态的潜在分子基础之一[15]。此外，该信号通路可通过调控内皮型一氧化氮合酶及一氧化氮水平维持血管内皮功能，显著改善微循环障碍，与“血瘀”所致的脑络瘀阻具有高度对应性[16]。综上所述，PI3K-Akt信号通路可能是补阳还五汤发挥益气活血作用、干预AHHBI铁死亡的关键靶标。

基于网络药理学分析，槲皮素、木犀草素、山柰酚、异鼠李素及β-谷甾醇为补阳还五汤干预AHHBI铁死亡的核心活性成分。其中，槲皮素、山柰酚和异鼠李素等黄酮类化合物可通过调节PI3K-Akt信号通路激活Nrf2/HO-1抗氧化体系，降低活性氧水平[17-18]；槲皮素和木犀草素还可激活Nrf2/SLC7A11信号通路，上调GPX4表达，直接抑制铁死亡[19-20]；β-谷甾醇则通过抑制NF-κB信号通路下调炎症因子，影响铁死亡进程[21]。本研究筛选出Akt1、TP53、TNF等关键靶点，富集于PI3K-Akt、HIF-1及NF-κB等信号通路。Akt1作为PI3K-Akt信号通路核心分子，其激活调控下游抗氧化与存活信号[22]；HIF-1与NF-κB信号通路则分别参与缺氧应激与炎症调控，间接影响铁死亡[23-24]。分子对接显示核心成分与关键靶点结合良好，尤以Akt1亲和力最强。综上所述，补阳还五汤可能通过活性成分靶向Akt1，激活PI3K-Akt信号轴抑制海马铁死亡，为后续实验提供了机制假说。

基于动物实验验证，补阳还五汤可调控AHHBI铁死亡及PI3K-Akt信号通路。铁死亡的特征性改变涉及多个关键分子：ACSL4上调提示细胞对铁死亡易感[25]；GPX4活性下降及其底物GSH耗竭是铁死亡的核心标志；SLC7A11作为system Xc-关键亚基，其下调可致GSH耗竭、GPX4失活，从而促进铁死亡[26]；游离Fe2+蓄积驱动脂质过氧化，其终产物MDA可作为铁死亡的检测指标[27]。本研究结果显示，低氧模型组ACSL4蛋白表达、Fe2+及MDA含量升高，GPX4、SLC7A11及GSH下降，与既往研究及已知机制相互印证[4]。PI3K/Akt作为神经元存活枢纽，其激活可上调GPX4、SLC7A11并抑制ACSL4，从而抵御铁死亡；反之，通路抑制则削弱保护作用[28]。本研究观察到海马组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值降低，而补阳还五汤干预后，二者比值显著升高且伴随着铁死亡相关指标逆转，提示PI3K/Akt激活可能是其抑制海马铁死亡、改善AHHBI的重要机制，也为网络药理学预测的核心靶点Akt1提供了功能佐证。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

[参考文献]

[1] 罗勇军，马四清. 急性高原反应发病的危险因素相关研究进展[J]. 第三军医大学学报，2019（8）：723-728.

[2] Gatterer H，Villafuerte F C，Ulrich S，et al. Altitude illnesses [J]. Nat Rev Dis Primers，2024，10（1）：43.

[3] Zhang Z，Sun Y，Yuan Z，et al. Insight into the effects of high-altitude hypoxic exposure on learning and memory [J].Oxid Med Cell Longev，2022，2022（1）：4163188.

[4] 常熙雯，赵安鹏，钟艳，等. 高原低氧暴露后小鼠海马铁死亡相关通路的变化[J]. 生理学报，2024，76（4）：507-516.

[5] Wang Y，Shen Z，Zhao S，et al. Sipeimine ameliorates PM2.5-induced lung injury by inhibiting ferroptosis via the PI3K/Akt/Nrf2 pathway：a network pharmacology approach [J].Ecotoxicol Environ Saf，2022，239：113615.

[6] Zheng Y，Lou S，Lu J，et al. Selective PI3Kδ inhibitor TYM-3-98 suppresses AKT/mTOR/SREBP1-mediated lipogenesis and promotes ferroptosis in KRAS-mutant colorectal cancer [J]. Cell Death Dis，2024，15（7）：474-484.

[7] 黎洁. 基于PI3K/AKT介导的细胞凋亡通路研究补阳还五汤对急性高原低氧脑损伤大鼠的保护作用[D]. 西宁：青海大学，2023.

[8] 蔡国英，刘均广，叶佳蓓，等. 补阳还五汤增强GPX4表达抑制铁死亡减轻脑缺血再灌注损伤[J]. 承德医学院学报，2024，41（1）：10-14.

[9] 黎洁，李永平，朱港星. 基于网络药理学研究补阳还五汤治疗急性高原低氧性脑损伤的作用机制[J]. 环球中医药，2023，16（5）：889-897.

[10] 胡小勤，蒙丹，曾学文，等. 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS和HPLC的广东产广地龙鲜、干品主要化学成分分析[J].天然产物研究与开发，2024，36（12）：2051-2063.

[11] 刘柏炎，陈博威，周胜强，等. 补阳还五汤调控Caveolin1-VEGF信号对脑缺血小鼠血管新生的影响[J]. 中华中医药杂志，2022，37（12）：7350-7354.

[12] Patir H，Sarada S K S，Singh S，et al. Quercetin as a prophylactic measure against high altitude cerebral edema [J].Free Radic Biol Med，2012，53（4）：659-668.

[13] 马露，张梦迪，温小娟，等. 高原缺氧性脑病的中西医研究进展[J]. 吉林医学，2022，43（3）：831-834.

[14] 杜松，张华敏，黄璐琦. 高原病中医病因病机理论探讨——兼论“氧”邪是第七淫[J].中医杂志，2025，66（24）：2509-2516.

[15] Ji X，Zhang C，Yang J，et al. Kaempferol improves exercise performance by regulating glucose uptake，mitochondrial biogenesis，and protein synthesis via PI3K/AKT and MAPK signaling pathways [J]. Foods，2024，13（7）：1068-1075.

[16] Liu Y，Zhou X，Xuan L. Magnesium lithospermate B ameliorates microcirculation perfusion in rats by promoting vascular NO production via activating the PI3K/AKT pathway [J]. Acta Pharmacol Sin，2019，40（8）：1010-1018.

[17] Rajendran P，Ammar R B，Al-Saeedi F J，et al. Kaempferol inhibits zearalenone-induced oxidative stress and apoptosis via the PI3K/Akt-mediated Nrf2 signaling pathway：in vitro and in vivo studies [J]. Int J Mol Sci，2020，22（1）：217-235.

[18] Lu X L，Zhao C H，Yao X L，et al. Quercetin attenuates high fructose feeding-induced atherosclerosis by suppressing inflammation and apoptosis via ROS-regulated PI3K/AKT signaling pathway [J]. Biomed Pharmacother，2017，85（1）：658-671.

[19] Li H，Qiu Z，Chen L，et al. Cadmium inhibits proliferation of human bronchial epithelial BEAS-2B cells through inducing ferroptosis via targeted regulation of the nrf2/SLC7A11/GPX4 pathway [J]. Int J Mol Sci，2025，26（15）：7204.

[20] Lv Y，Weng X，Zhu Y，et al. Quercetin alleviates postmenopausal atherosclerosis by suppressing endothelial cell ferroptosis via regulating the KEAP1/NRF2/GPX4 signalling pathway [J]. Br J Pharmacol，2026，183（3）：620-643.

[21] Zhang F，Liu Z，He X，et al. β-Sitosterol-loaded solid lipid nanoparticles ameliorate complete Freund’s adjuvant-induced arthritis in rats：involvement of NF-кB and HO-1/Nrf-2 pathway [J]. Drug delivery，2020，27（1）：1329-1341.

[22] Hoxhaj G，Manning B D. The PI3K-AKT network at the interface of oncogenic signalling and cancer metabolism [J].Nat Rev Cancer，2020，20（2）：74-88.

[23] Hu W，Cai Y，Cai D，et al. HIF-1α alleviates ferroptosis in ulcerative colitis by regulation of GPX4 [J]. Cell Death Dis，2025，16（1）：542-556.

[24] Chen Y，Fang Z M，Yi X，et al. The interaction between ferroptosis and inflammatory signaling pathways [J]. Cell Death Dis，2023，14（3）：205-218.

[25] Ding K，Liu C，Li L，et al. Acyl-CoA synthase ACSL4：an essential target in ferroptosis and fatty acid metabolism [J].Chin Med J（Engl），2023，136（21）：2521-2537.

[26] Wang Y，Zhang J，Wang Z，et al. Folic acid ameliorates neuronal ferroptosis in aging by Up-regulating SLC7A11-GSH-GPX4 antioxidant pathway and increasing cystine levels [J]. Chin Med J（Engl），2025，26（14）：6669.

[27] Rochette L，Dogon G，Rigal E，et al. Lipid peroxidation and iron metabolism：two corner stones in the homeostasis control of ferroptosis [J]. Int J Mol Sci，2022，24（1）：449.

[28] Hu S，Fei Y，Jin C，et al. Ginsenoside Rd enhances bloodbrain barrier integrity after cerebral ischemia/reperfusion by alleviating endothelial cells ferroptosis via activation of NRG1/ErbB4-mediated PI3K/Akt/mTOR signaling pathway [J]. Neuropharmacology，2024，251：109929.

Mechanistic study of Buyang Huanwu Decoction’s PI3K/Akt-mediated modulation of ferroptosis in acute high-altitude hypoxic brain injury

ZHU Zhifang HUANG Shanshan GUO Xuejing OUYANG Shuai LI Yongping

Department of Traditional Chinese Medicine, Qinghai University Medical College, Qinghai Province, Xining 810001, China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Buyang Huanwu Decoction on ferroptosis in acute high-altitude hypoxic brain injury (AHHBI) and its underlying molecular mechanism. Methods The active components of Buyang Huanwu Decoction were screened using the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, HERB, and SWISSADME platforms,and their corresponding targets were predicted by the SwissTargetPrediction database. Disease-related targets and ferroptosis-related targets were obtained from the OMIM, GeneCards, and FerrDb databases. After intersecting these three sets of targets, protein-protein interaction network was constructed using the STRING database. A “drugcomponent-target” network was built with Cytoscape, followed by topological analysis to identify core targets and key components. Gene ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analyses were performed on the intersecting targets, and molecular docking validation was conducted using AutoDock. For animal experiment validation, Fifty-four SPF-grade male C57BL/6J mice (7-8 weeks old, 20-25 g in body mass) were divided into normal control group, hypoxia model group, low-dose (9.26 g/kg), medium-dose (18.53 g/kg), high-dose (37.06 g/kg)groups of Buyang Huanwu Decoction, and Dexamethasone group (4 mg/kg) according to the random number table method. Each group contained nine mice. The normal control group and the hypoxia model group were given normal saline. Each group was administered the prescribed dose once a day. After four days of administration, except for the normal control group, all other groups were placed in a simulated 6 000 m low-oxygen chamber and kept for three days to establish the AHHBI model. The levels of serum malondialdehyde (MDA) and glutathione (GSH) were detected by enzyme-linked immunosorbent assay; the Fe2+ content in hippocampus tissue was determined by colorimetry; the protein expressions of ACSL4, GPX4, SLC7A11, p-PI3K, PI3K, p-Akt, and Akt in hippocampal tissue were detected by Western blot, and the ratios of p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt were calculated; the mRNA expressions of ACSL4, GPX4,and SLC7A11 were detected by RT-qPCR. Results A total of 29 intersecting targets were obtained, with the prominent targets identified as TP53, TNF, IL-6, Akt1, and HIF-1α. The top five effective components were determined to be quercetin, luteolin, kaempferol, isorhamnetin, and β-sitosterol. Through GO enrichment analysis, 2 112 entries were identified, consisting of 1 922 biological processes, 34 cellular components, and 156 molecular functions, which were primarily involved in signal transduction, metabolic regulation, and stress response. Additionally, 153 KEGG pathways were significantly enriched, with the top 20 being mainly associated with HIF-1, TNF, reactive oxygen species, PI3K-Akt, and FoxO signaling pathways. Molecular docking analysis revealed that Akt exhibited the strongest binding affinity with the key components. Animal experiment results: compared with the normal control group, the GSH level in the hypoxia model group was decreased, while the MDA level and Fe2+ content were increased (P＜0.05). Compared with the hypoxia model group, GSH levels in the medium and high-dose groups of Buyang Huanwu Decoction were increased,while the MDA levels were decreased, and Fe2+ in the each dose group of Buyang Huanwu Decoction was decreased to varying degrees (P＜0.05). Compared with the normal control group, the expressions of ACSL4 protein and mRNA of the hypoxia model group mice were increased (P＜0.05), while the expressions of GPX4 and SLC7A11 protein and mRNA were decreased (P＜0.05). Compared with the hypoxia model group, the expression of SLC7A11 protein in the low-dose group of Buyang Huanwu Decoction was increased (P＜0.05), while the expression of ACSL4 protein and mRNA in the medium-dose group of Buyang Huanwu Decoction was decreased (P＜0.05), and the expression of SLC7A11 protein was increased (P＜0.05). In the high-dose group of Buyang Huanwu Decoction, the expression of ACSL4 protein and mRNA was decreased (P＜0.05), and the protein and mRNA expressions of GPX4 and SLC7A11 were increased (P＜0.05).Compared with the normal control group, the ratio of p-Akt/Akt protein in the hypoxia model group was decreased (P＜0.05). Compared with the hypoxia model group, the ratios of p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt proteins in each dose group of the Buyang Huanwu Decoction were all increased (P＜0.05). Conclusion Buyang Huanwu Decoction can effectively inhibit ferroptosis in acute high-altitude hypoxic brain injury, and its mechanism of action may be related to the activation of the PI3K-Akt signaling pathway.

[Key words] Buyang Huanwu Decoction; Acute high-altitude hypoxic brain injury; Network pharmacology; Molecular docking; Ferroptosis

[中图分类号] R2-031；R277.7；R594.3

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）07（b）-0057-10

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25111949

[基金项目] 青海省“昆仑英才·高层次教育教学人才”项目；青海省中藏医药科研课题项目（J2023003）。

[作者简介] 朱智芳（1998-），女，青海大学医学院中医系2023级中西医结合临床专业在读硕士研究生；研究方向：高原病中医药干预。

[通讯作者] 李永平（1978-），男，博士，教授，硕士生导师；研究方向：针灸及中医药防治高原病的机制。

（收稿日期：2025-11-24）

（修回日期：2026-03-05）