欢迎访问《中国医药导报》编辑部！

膀胱癌（bladder cancer，BLCA）是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，起源于膀胱黏膜上皮细胞（epithelial cells，EpiCs），占尿路上皮癌的90%～95%[1]。根据2022年全球癌症统计，BLCA在全球新发癌症中发病率位居第9位，死亡率位居第13位，且较2020年其发病率与死亡率均有所上升[2-3]。尽管诊疗手段不断进步，但BLCA患者的总体预后仍不理想，免疫治疗效果差异及耐药等问题依然突出，其发生和发展可能与肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）、肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）的复杂性与异质性密切相关[4-5]。因此，深入解析BLCA关键细胞亚群及其调控基因对阐明疾病机制和寻找新靶点具有重要意义。

TME由免疫细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞及细胞外基质等构成，与肿瘤细胞通过细胞因子信号和代谢互作共同影响肿瘤进展[6-7]。EpiCs作为BLCA的起源细胞，其异质性在肿瘤发生、免疫逃逸及治疗应答中起核心作用[8-9]。同时，TMB反映基因突变数量，高TMB与更多新抗原生成和免疫治疗获益密切相关[10-11]。然而，TMB无法揭示特定细胞亚群的功能差异，联合单细胞组学分析可在突变与转录层面实现多维整合，从而更精准地刻画细胞异质性。

本研究整合单细胞转录组、全外显子组和机器学习等方法，对BLCA的TME及关键枢纽基因进行系统解析[12-13]。通过WES数据计算TMB并映射至EpiCs亚群，鉴定出特征性亚群Epi14。进一步结合随机生存森林算法筛选其枢纽基因，从多组学、多维度的角度揭示BLCA的EpiCs的分子特征与关键调控机制，为BLCA的精准治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2024年9月至2025年9月新疆生产建设兵团医院BLCA患者的癌组织与癌旁组织30对，其中15对用于送转录组测序和全外显子组测序（whole exome sequencing，WES），剩余15对用于后续实验分析。本研究方案经新疆生产建设兵团医院伦理委员会批准（202403401），每例患者在参与试验前均获得了书面知情同意，且本研究严格遵循《赫尔辛基宣言》（2013年修订版）相关原则开展。并从GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载单细胞数据集GSE222315，共纳入13例单细胞样本；下载GSE236932数据集，包含63个转录组样本；从TCGA数据库（https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga）获取BLCA表达数据共421个转录组样本，总转录组样本共514例。

1.2 全外显子中TMB值的计算

获取原始数据后，使用ANNOVAR对测序公司提供的体细胞突变结果进行功能注释。为避免多转录本注释带来的冗余计数，根据染色体、位置、参考碱基及替代碱基构建唯一突变位点并去重。筛选非同义突变类型，包括missense、nonsense和splicing等信息，剔除同义突变及非编码区变异。每例样本的TMB计算方式为筛选后的非同义突变总数除以靶向区域长度（38 Mb），以Mut/Mb表示。由于BLCA整体TMB水平相较黑色素瘤、肺癌等癌种偏低，且固定阈值（如10 Mut/Mb）在小样本量中易造成组间不平衡，影响统计稳健性，故本研究根据TMB中位数（7.53 Mut/Mb）将样本分为高TMB组与低TMB组用于后续单细胞与转录组分析。

1.3 scRNA-seq数据的质量质控和细胞注释

根据基因检测数、线粒体及核糖体等基因占比进行质控。异常值以与中位数偏离超过3倍中位数绝对偏差定义。保留基因数200～4 612、UMI数＜13 026.67且线粒体基因比例＜4.85%的细胞用于后续分析。随后进行标准化、主成分分析（principal component analysis，PCA）及统一流形近似与投影（uniform manifold approximation and projection，UMAP）非线性降维。聚类结果参考CellMarker数据库（http://www.bio-bigdata.center/index.html）及既往单细胞转录组研究中已报道的细胞类型标记基因文献进行人工校正，并结合SingleR自动注释以确定各细胞类型及其特征标记基因。

1.4 scAB算法鉴定TMB相关EpiCs及期望度

提取EpiCs，进行二次聚类分析。依次执行PCA和UMAP降维，获得EpiCs亚群分布。将TMB值映射至单细胞数据，利用scAB算法识别与TMB水平显著相关的EpiCs亚群。采用Ro/e算法分析各亚群细胞数的富集程度，以确定与TMB High特征最相关的细胞群，最终鉴定出Epi14为TMB High相关EpiCs亚群。

1.5 差异基因的鉴定及富集分析

以|log2FC|＞0.585且校正后的P＜0.05为筛选条件，计算scAB+cells和Other cells的相关差异基因，并对目标基因进行功能注释，以全面探索差异基因的功能相关性。

1.6 配体-受体相互作用分析及细胞分化与拟时序分析

将EpiCs划分为TMB Epi组与Other Epithelial组，使用CellChat包推断两组间的配体-受体相互作用网络。为评估细胞的干性与分化潜能，采用CytoTRACE算法进行轨迹重建与分化状态评分，使用Monocle 2包进行拟时序分析。

1.7 机器学习联合全外显子明确关键枢纽基因

采用随机生存森林算法，利用randomForestSRC包对前述差异基因进行生存分析。将相对重要性＞0.2的基因确定为候选特征基因。随后在自测队列、TCGA及GSE236932数据集中验证其表达差异。进一步结合WES数据，分析关键基因表达水平与TMB的相关性，最终筛选出与TMB显著相关的候选枢纽基因。

1.8 Western blot法验证相关蛋白

每份组织取10 mg，加入含RIPA裂解液、PMSF及蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中，充分震荡裂解、离心后取上清液。采用BCA法测定蛋白浓度，按1∶4比例与5×Loading Buffer混匀，在100 ℃金属浴中加热10 min变性。经电泳分离后转膜至PVDF膜，使用快速封闭液封闭并以含Tween的TBST充分洗涤。分别与ABRACL（货号：PA5-56401，美国Thermo Fisher Scientific公司）（稀释比1∶2 000）、ARPC3（货号：14652-1-AP，武汉三鹰生物技术有限公司）（稀释比1∶1 000）及β-actin（货号：SA00001-2，武汉三鹰生物技术有限公司）（稀释比：1∶2 500）一抗于4 ℃孵育过夜，次日TBST洗膜后，于室温孵育二抗1 h，再经洗涤后使用ECL显影检测；以β-actin为内参，对癌组织与癌旁组织中ABRACL和ARPC3蛋白表达水平进行分析。

1.9 统计学方法

采用R 4.5.1软件及相应R包进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（

）表示，组间比较采用t检验；不符合正态分布的计量资料以中位数（四分位数）[M（P25，P75）]表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验。计数资料以例数表示，组间比较采用χ2检验；生存分析采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，并采用log-rank检验进行比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 单细胞转录组揭示BLCA的细胞簇

经分析后共识别出32个细胞簇（图1A）。经过注释明确10种主要细胞类型，包括EpiCs、T细胞和B细胞等类型（图1B）。并显示各细胞类型的特征标记基因表达情况（图1C），进一步比较癌组织与癌旁组织中不同细胞类型的组成比例，结果显示EpiCs类型在癌组织中占比约25%，但在癌旁组织中占比约2%，差值最为显著（图1D）。

2.2 EpiCs亚群再聚类与TMB相关差异基因分析

将EpiCs进行二次聚类后，筛选出19个细胞亚群（图2A）。利用scAB算法结合TMB值鉴定与高TMB显著相关的细胞，定义为scAB cells（图2B）。通过Ro/e算法发现scAB cells主要聚集于Epi14亚群，而Other cells数量低于期望值（图2C），因此将Epi14确定为与高TMB特征显著相关的EpiCs亚群。进一步提取Epi14相关基因，对scAB cells与Other cells进行差异分析，筛选得到119个差异基因（图2D）。富集结果显示，这些基因主要富集于胞质核糖体、呼吸链复合体等通路（图2E）。

2.3 配体-受体互作、细胞分化状态和拟时序分析结果

通过细胞通讯分析发现不同细胞群间存在复杂的信号网络（图3A）。其中，TMB-Epi细胞与内皮细胞及成纤维细胞之间的互作最为显著（图3B）。同时，成纤维细胞主要通过MDK-SDC1与MDK-NCL信号轴与TMB-Epi细胞群进行通信（图3C）。采用Cyto-TRACE评估EpiCs的干性与分化潜能。发现从Epi4至Epi15亚群，细胞干性逐渐下降（图3D～E）。而Epi14细胞位于中等偏高干性区域，提示其兼具较高的TMB与潜在的分化能力。为进一步解析EpiCs的发育轨迹，使用Monocle 2进行拟时序分析（图3F～H）。

2.4 机器学习筛选枢纽基因

采用RSF算法对差异基因进行特征筛选，最终确定ABRACL、ARPC3、BHLHE41、STRAP这4个关键基因（图4A）。生存分析显示其表达水平与患者总体生存显著相关（图4B～E）。进一步在自测数据集、TCGA及GSE236932队列中验证，发现ABRACL和ARPC3在肿瘤组织中显著上调（图4F～H）。结合TMB数据分析发现，ABRACL高表达样本的TMB值显著升高，低表达组则明显降低（图4I）。

2.5 ABRACL、ARPC3实验验证结果

Western blot法检测结果显示，ARPC3与ABRACL在BLCA组织中蛋白水平显著高于癌旁正常组织（图5A～F）。该结果与多组学分析结果一致，进一步验证了两者在BLCA中的高表达特征。

3 讨论

BLCA是一种起源于膀胱尿路上皮黏膜的恶性肿瘤，具有较为显著的异质性，其发生和发展受到TMB、TME的共同影响[14]。然而，TMB不仅反映基因组不稳定性，还与TME的重塑密切相关。本研究通过联合分析发现，TMB相关的Epi14即EpiCs亚群与成纤维细胞、巨噬细胞及内皮细胞之间存在活跃的配体-受体互作，提示高TMB状态下的EpiCs可能通过改变分泌表型及细胞间信号交流方式，间接参与TME的调控。ABRACL与ARPC3作为在该亚群中高表达的关键基因，其功能主要涉及细胞骨架重组、细胞迁移及应激适应，这些过程被认为与肿瘤细胞与微环境成分的动态互作密切相关[15]。因此，ABRACL和ARPC3可能并非直接调控免疫或基质细胞，而是通过影响肿瘤EpiCs的状态与行为，间接参与TME的重塑过程[16]。同时，高TMB肿瘤通常伴随较高的复制压力、转录活性及代谢需求。本研究发现Epi14亚群差异基因主要富集于蛋白质翻译及线粒体能量代谢相关通路，提示该细胞群可能处于高代谢和高应激状态。ABRACL与ARPC3的高表达可能反映肿瘤细胞在高突变负荷背景下，对细胞骨架动态调节和能量代谢重编程的适应性改变，而非其直接驱动突变积累过程。本研究存在一定的局限性，包括自测WES样本量有限及缺乏直接功能实验验证。未来将结合更大规模队列、空间转录组及功能实验进一步验证相关结论。

本研究通过多组学分析，揭示了EpiCs的异质性和TMB的关联。探索出与高TMB显著相关的EpiCs亚群Epi14，并筛选出枢纽基因ABRACL与ARPC3。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

[1] Paner G P，Stadler W M，Hansel D E，et al. Updates in the eighth edition of the Tumor-Node-Metastasis staging classification for urologic cancers [J]. Eur Urol，2018，73（4）：560-569.

[2] Bray F，Laversanne M，Sung H，et al. Global cancer statistics 2022：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries [J]. CA Cancer J Clin，2024，74（3）：229-263.

[3] 王培宇，黄祺，王少东，等. 《全球癌症统计数据2022》要点解读[J]. 中国胸心血管外科临床杂志，2024，31（7）：933-954.

[4] Merino D M，McShane L M，Fabrizio D，et al. Establishing guidelines to harmonize tumor mutational burden（TMB）：in silico assessment of variation in TMB quantification across diagnostic platforms: phase Ⅰ of the Friends of Cancer Research TMB Harmonization Project [J]. J Immunother Cancer，2020，8（1）：e000147.

[5] Vega D M，Yee L M，Mcshane L M，et al. Aligning Tumor Mutational Burden（TMB）quantification across diagnostic platforms：phase 2 of the friends of cancer research TMB harmonization project [J]. The Annals，2021，32（12）：1626-1636.

[6] Yang D，Zhao F，Su Y，et al. Analysis of M2 macrophageassociated risk score signature in pancreatic cancer TME landscape and immunotherapy [J]. Front Mol Biosci，2023，10：1184708-1184708.

[7] Gargalionis N A，Papavassiliou A K，Basdra K E，et al. Advances in non-small cell lung cancer mechanomedicine：deciphering the signaling networks that govern tumor-TME interactions [J]. J Exp Clin Cancer Res，2024，43（1）：316-316.

[8] Li F，Zhang H，Huang Y，et al. Single-cell transcriptome analysis reveals the association between histone lactylation and cisplatin resistance in bladder cancer [J]. Drug Resist Updat，2024，73：101059.

[9] Li Y，Shi P，Ding Y，et al. Single cell analysis identified a basal cell transition state associated with the development and progression of bladder cancer [J]. J Transl Med，2024，22（1）：1010.

[10] Yang Y，Shen S，Sun Y，et al. The relationship between different subtypes of KRAS and PD-L1 & tumor mutation burden（TMB）based on next-generation sequencing（NGS）detection in Chinese lung cancer patients [J].Transl Lung Cancer Res，2022，11（2）：213-223.

[11] Ramos-Paradas J，Hernández-Prieto S，Lora D，et al. Tumor mutational burden assessment in non-small-cell lung cancer samples： results from the TMB2 harmonization project comparing three NGS panels [J]. J Immunother Cancer，2021，9（5）：e001904.

[12] Xavier B C，Guardia A D G，Alves B P J，et al. Identifying predictors of overall survival among patients with TMB-low metastatic cancer treated with immune checkpoint inhibitors [J]. The oncologist，2025，30（4）：oyaf078.

[13] Zheng H，An M，Luo Y，et al. PDGFRα+ITGA11+fibroblasts foster early-stage cancer lymphovascular invasion and lymphatic metastasis via ITGA11-SELE interplay [J].Cancer cell，2024，42（4）：682-700.e12.

[14] Cao Y，Wang S，Ma J，et al. Mechanistic insights into SIRT7 and EZH2 regulation of cisplatin resistance in bladder cancer cells [J]. Cell Death Dis，2024，15（12）：931-931.

[15] Zhao C，Wu Z，Yao Z，et al. The tumorigenic effect of the high expression of ABRACL in glioma and its potential as a therapeutic target [J]. Heliyon，2024，10（17）：e36597-e36597.

[16] Wang T Y，Liao Y Q，Dong Z Y，et al. Compound kushen injection inhibits breast cancer lung metastasis through regulating MTSS1/ARPC3/F-actin [J]. J Ethnopharmacol，2025，350：120054.

【作者机构】	¹新疆生产建设兵团医院泌尿外科； ²石河子大学医学院
【分类号】	R737.14
【基金】	新疆维吾尔自治区“天山英才”基金项目（兵卫函〔2024〕15号）新疆生产建设兵团医院科研计划项目（2024002） “天山英才”医药卫生高层次人才——中青年骨干医疗人才培养计划项目（TSYC202401B138）。

基于多组学整合分析筛选膀胱癌肿瘤突变负荷相关枢纽基因

目录

文内图表