基于HPLC指纹图谱与抗氧化谱效关系的和胃降逆胶囊质量标志物研究

李莎莎1, 赵宗平2, 蔡萌萌2, 毛阿娟1, 李芳1, 李凡1, 王卫锋1

【作者机构】 1陕西省中医药研究院中药研究所; 2陕西威信制药有限公司
【分 类 号】 R284.1
【基    金】 陕西省重点研发计划项目(2024SF-YBXM-481)。
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基于HPLC指纹图谱与抗氧化谱效关系的和胃降逆胶囊质量标志物研究

基于HPLC指纹图谱与抗氧化谱效关系的和胃降逆胶囊质量标志物研究

李莎莎1 赵宗平2 蔡萌萌2 毛阿娟1 李 芳1 李 凡1 王卫锋1

1.陕西省中医药研究院中药研究所,陕西西安 710003;2.陕西威信制药有限公司,陕西西安 710065

[摘要] 目的 建立和胃降逆胶囊的HPLC指纹图谱,初步考察其体外抗氧化作用。 方法 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》建立和胃降逆胶囊的HPLC指纹图谱并进行相似度评价,确定共有峰;采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除实验考察和胃降逆胶囊的抗氧化活性;采用灰色关联度分析、偏最小二乘回归分析(PLS)、Pearson相关性分析和胃降逆胶囊HPLC指纹图谱与其抗氧化活性之间的谱效关系。 结果 本研究建立了11批和胃降逆胶囊的指纹图谱,相似度均>0.900,共确定共有峰25个,指认了其中5个,分别是绿原酸、菊苣酸、虎杖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黄素。DPPH自由基清除实验的半数抑制浓度(IC50)为0.409~0.799 mg/ml。灰色关联度分析结果显示,16个共有峰对DPPH自由基的清除率的r值>0.70;PLS和Pearson相关性分析结果显示,峰4和峰16的相关系数及回归系数与DPPH自由基清除率IC50值呈负相关且变量投影重要性值>1。 结论 11批和胃降逆胶囊均具有较好的抗氧化活性,其发挥抗氧化作用是内部抗氧化成分群协同作用的结果。共有峰4和16所对应的成分与其抗氧化活性密切相关,为抗氧化活性的主要有效成分,揭示了和胃降逆胶囊抗氧化活性的药效物质基础,为该药的质量标志物研究提供参考。

[关键词] 和胃降逆胶囊;抗氧化;指纹图谱;谱效关系;质量标志物

慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)是胃癌发展过程中的关键环节。在CAG发生、发展中,常伴随氧化应激平衡(氧化/抗氧化失调)的持续破坏,由慢性炎症引发的氧化应激主要源自免疫细胞和胃黏膜细胞,是诱发细胞DNA损伤、凋亡及癌变的关键因素[1-2]

和胃降逆胶囊组方源自毛水龙先生的经验方,由朱砂七、太白楤木、老龙皮、天仙藤、煅赭石和蒲公英6味中药组成,具有活血理气、清热化瘀、和胃降逆的功效[3]。现代研究表明,和胃降逆胶囊能够显著改善CAG患者的临床症状、胃镜下胃黏膜征象及胃黏膜萎缩状态[4-5]。然而,该药改善CAG胃黏膜组织是否与清除体内过量过氧化物有关尚不明确。目前,和胃降逆胶囊研究主要集中在工艺、质量控制和肿瘤相关药理学方面[6-9];而关于质量标志物(quality markers,Q-Marker)的研究属于空白,且具体是哪些成分发挥抗氧化作用尚未明确。基于此,本研究通过灰色关联度分析、偏最小二乘回归分析(partial least squares,PLS)、Pearson相关性分析与和胃降逆胶囊HPLC指纹图谱、体外抗氧化活性之间的关联性,初步探讨其体外发挥抗氧化作用的物质基础,以期为和胃降逆胶囊Q-Marker的确定提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器

高效液相色谱仪(型号:LC-2010型,日本岛津公司);酶标仪(型号:Multiskan Sky型,美国赛默飞世尔科技公司);粉碎机(型号:DFT-200A型,温岭市林大机械有限公司);超声波清洗器(型号:KQ-5200E型,昆山市超声仪器有限公司);电子分析天平(型号:BS210S型万分之一和BT25S型十万分之一,北京赛多利斯科学仪器有限公司)。

1.2 试药

大黄素对照品(含量以96.0%计,批号:110756-201913)、绿原酸对照品(含量以96.3%计,批号:110753-202119)、菊苣酸对照品(含量以98.7%计,批号:111752-202105)、虎杖苷对照品(含量以87.3%计,批号:111575-201603)均购自中国食品药品检定研究院;大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品(含量 ≥98.0%,批号:CHB250522)购自成都克洛玛生物科技有限公司;抗坏血酸对照品(批号:20250507)购自天津市大茂化学试剂合伙企业;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)(批号:C12555134)购自德国默克公司;甲醇、乙腈和甲酸为色谱级;其他试剂均为分析纯;水为娃哈哈纯净水。

和胃降逆胶囊(每粒装0.4 g,有效期30个月)共11批,编号为S1~S11,批号分别为190501、190502、190503、210201、210501、211101、211102、211103、220301、220401、230801,由陕西威信制药有限公司生产。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品储备液

取虎杖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、绿原酸、菊苣酸和大黄素对照品适量,精密称定,分别置于不同10 ml量瓶中,加甲醇定容,得到对照品母液;精密量取各母液适量置于同一10 ml量瓶中,甲醇定容,配制成质量浓度分别为0.205 8、0.185 2、0.110 4、0.205 0、0.185 4 mg/ml的混合对照品,备用。

2.1.2 供试品溶液

精密称定和胃降逆胶囊内容物1.0 g,置于具塞三角瓶中,加入70%甲醇50 ml,称量,超声处理45 min,放凉至室温,用70%甲醇补足减失的量,0.22 μm微孔滤膜滤过,即得样品溶液A。将部分样品溶液A加70%甲醇稀释,配制成不同质量浓度(0.023 4、0.046 9、0.093 8、0.187 5、0.375 0、0.750 0、1.500 0 mg/ml)的样品溶液B。样品溶液A用于指纹图谱的建立,样品溶液B用于DPPH自由基清除实验。

2.1.3 抗坏血酸阳性对照溶液

精密称取抗坏血酸适量,置于5 ml容量瓶中,加70%乙醇溶解并定容,摇匀,即得阳性对照溶液[10-11]。后续实验根据需要浓度,取一定量定容至10 ml容量瓶中,配制成不同浓度的抗坏血酸阳性对照溶液。

2.1.4 DPPH自由基溶液

精密称取DPPH适量,置于100 ml容量瓶中,加70%乙醇溶解并定容,摇匀,即得0.2 mmol/L的自由基溶液[10-11]

2.2 和胃降逆胶囊指纹图谱的建立

2.2.1 色谱条件

色谱柱为AGILENT Poroshell 120 EC-C18(150 mm× 4.6 mm,4 μm),以0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相,梯度洗脱。洗脱程序为:0~5 min,10%B→18%B;5~35 min,18%B→25%B;35~50 min,25%B→30%B;50~80 min,30%B→80%B;80~85 min,80%B→10%B;85~90 min,10%B。流速为0.3 ml/min,柱温为20 ℃,检测波长为250 nm,进样量为10 μl。

2.2.2 方法学考察

2.2.2.1 精密度 按照“2.2.1”项下色谱条件,将“2.1.2”项下样品溶液A(编号:S1)连续进样测定6次,记录各共有峰的保留时间和峰面积,以8号色谱峰的保留时间和峰面积为参照,计算各共谱峰相对保留时间的RSD值均 ≤0.58%、相对峰面积的RSD值均 ≤3.02%,提示仪器的精密度良好,符合指纹图谱的技术要求。

2.2.2.2 稳定性 按照“2.2.1”项下色谱条件,将分别于室温放置0、2、4、6、8、10、12、24 h的样品溶液A(编号:S1)进样测定,以8号色谱峰保留时间和色谱峰面积为参照,计算各色谱峰的相对保留时间的RSD值 ≤0.46%,相对峰面积的RSD值 ≤3.38%,提示样品溶液在室温放置24 h内稳定性良好。

2.2.2.3 重复性 按照“2.1.2”项下方法制备同一批次(编号:S1)供试品溶液6份,按照“2.2.1”项下色谱条件进样测定,以8号色谱峰的保留时间和色谱峰面积为参照,计算各色谱峰相对保留时间的RSD值 ≤0.45%,相对峰面积的RSD值 ≤3.34%,提示本方法重复性良好。

2.2.3 指纹图谱的生成和共有峰的指认

取11批和胃降逆胶囊样品,按照“2.1.2”项下方法制备样品溶液A,“2.2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)》,以S1样品的色谱图为参照图谱,时间窗宽度为0.1,以平均数法生成叠加指纹图谱,通过多点校正,经Mark峰匹配后生成对照图谱R。通过对比混合对照品溶液,进行色谱峰的识别和指认,共标定25个共有峰,并指认出其中5个共有峰:峰3为绿原酸、峰4为菊苣酸、峰5为虎杖苷、峰16为大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、峰25为大黄素。见图1、图2。

图1 11批和胃降逆胶囊的指纹图谱叠加图

图2 混合对照品的HPLC图谱

2.2.4 相似度评价

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)》对11批样品进行相似度评价,结果显示,11批样品与对照指纹图谱R的相似度分别为0.988、0.989、0.994、0.973、0.995、0.983、0.995、0.997、0.989、0.980、0.988,提示11批样品化学成分组成具有较好的一致性。

2.3 DPPH自由基清除率实验

取“2.1.3”项下阳性对照溶液、“2.1.2”项下系列样品溶液B各100 μl,加至96微孔板中,再加入“2.1.4”项下DPPH自由基溶液100 μl,避光反应30 min后,使用酶标仪于517 nm波长处测光密度值。

按照公式计算DPPH自由基清除率,计算公式为:清除率=[1-(A2-A1)/A0]×100%,A2为样品光密度值(样品溶液+DPPH自由基溶液);A1为样品本底光密度值(样品溶液+70%甲醇溶液);A0为空白对照光密度值(70%甲醇溶液+DPPH自由基溶液);平行测定3次。同法处理抗坏血酸阳性对照溶液,计算各样品的半数抑制浓度(IC50)。结果显示,抗坏血酸的IC50值为0.492 μg/ml,11批样品均具有清除DPPH自由基的能力;基于IC50值,对样品的DPPH自由基清除能力进行由大到小排序,即S4、S3、S2、S8、S11、S7、S10、S5、S6、S1、S9。见表1。

表1 和胃降逆胶囊的体外抗氧化活性测定结果

编号DPPH IC50编号DPPH IC50编号DPPH IC50 S10.628±0.033S50.525±0.019S90.799±0.017 S20.459±0.016S60.552±0.026S100.515±0.010 S30.416±0.004 S70.506±0.011S110.484±0.013 S40.409±0.044S80.472±0.012

注 DPPH:1,1-二苯基-2-三硝基苯肼;IC50:半数抑制浓度。

2.4 和胃降逆胶囊HPLC指纹图谱与抗氧化活性的灰色关联度分析结果

采用均值化对峰面积和表1数据进行无量纲化处理,以DPPH自由基清除率试验的IC50值为参考序列,25个共有峰的峰面积为比较序列,分辨系数p为0.5,计算二者之间的关联度(r),并对其进行排序,结果见表2。通过r可初步确定所对应化学成分与抗氧化活性之间的关系,r值越大,说明化学成分与抗氧化作用的关联性越大,反之则越小[12]。结果显示,25个共有峰的r值均 ≥0.543,提示和胃降逆胶囊的体外抗氧化作用是多成分协同作用的结果。根据r值的大小,确定共有峰对体外抗氧化活性的贡献大小顺序为:峰11>峰18>峰19>峰16(大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷)>峰5(虎杖苷)>峰13>峰8>峰7>峰15>峰14>峰9>峰21>峰4(菊苣酸)>峰10>峰17>峰3(绿原酸)>峰1>峰25(大黄素)>峰2>峰24>峰23>峰12>峰22>峰6>峰20。其中,16个共有峰对DPPH自由基的清除率的r值>0.70,表现出强关联性。

表2 各共有峰与DPPH的关联度

40.74013130.7706210.7421250.7785140.75410220.6182390.74611峰号关联度关联序峰号关联度关联序峰号关联度关联序10.69317100.73714180.798220.65719110.8141190.793330.72916120.62422200.5432560.55624150.7549230.6402170.7638160.7894240.6402080.7667170.73015250.67418

注 DPPH:1,1-二苯基-2-三硝基苯肼。

2.5 和胃降逆胶囊HPLC指纹图谱与抗氧化活性的PLS结果

将11批和胃降逆胶囊HPLC指纹图谱中25个共有峰的峰面积和DPPH自由基清除率实验的IC50值导入SIMCA 14.1软件进行PLS模型拟合分析,以峰面积为自变量(X),IC50值为因变量(Y),得到回归方程Y=-0.060 290X1+0.021 945X2+0.004 631X3-0.171 820X4-0.099 360X5-0.047 200X6-0.064 310X7+0.001 616X8+0.123 839X9+0.066 989X10-0.040 090X11+0.199 126X12+0.007 966X13+0.065 450X14-0.007 640X15-0.256 750X16-0.001 200X17-0.005 170X18-0.270 030X19+0.068 526X20-0.116 810X21-0.069 120X22-0.094 490X23-0.183 300X24-0.094 550X25;回归方程中回归系数为正值说明其与自由基清除率呈正相关,负值则表示与自由基清除率呈负相关。

由图3可知,共有9个共有峰回归系数为正值,即与DPPH自由基清除率的IC50值呈正相关,相关性大小依次为:峰12、峰9、峰20、峰10、峰14、峰2、峰13、峰3(绿原酸)和峰8;16个共有峰与DPPH自由基清除率IC50值呈负相关,相关性大小依次为:峰19、峰16(大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷)、峰24、峰4(菊苣酸)、峰21、峰5(虎杖苷)、峰25(大黄素)、峰23、峰22、峰7、峰1、峰6、峰11、峰15、峰18和峰17。

图3 标准化回归系数

变量投影重要性(variable importance in projection,VIP)值是PLS分析中的一个重要指标,VIP值越大,说明自变量X的解释能力越强,VIP值>1,则说明该活性成分与药效呈显著相关[13]。由图4可知,VIP值>1的特征峰有8个,分别为峰16(大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷)、峰19、峰12、峰24、峰4(菊苣酸)、峰9、峰1和峰25(大黄素),其中峰16的VIP值最大,提示大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷对和胃降逆胶囊抗氧化作用的贡献最大。

图4 VIP值得分图

2.6 和胃降逆胶囊HPLC指纹图谱与抗氧化活性的Pearson相关性分析结果

对11批和胃降逆胶囊HPLC指纹图谱中25个共有峰的峰面积与DPPH自由基清除实验的IC50值进行Z-Score标准化处理,采用Pearson相关性分析对二者之间的谱效关系进行研究。结果显示,峰1、峰4(菊苣酸)、峰6、峰7、峰8、峰16(大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷)、峰18、峰20、峰21、峰22、峰23、峰24和峰25(大黄素)与DPPH自由基清除率的IC50值的r值<-0.300;峰16(大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷)的峰面积与DPPH自由基清除实验的IC50呈负相关(r=-0.603,P<0.05),推测上述相关色谱峰对应的有效成分含量增高时,其清除自由基的IC50值变小,即自由基的清除能力增强。见表3。

表3 Pearson相关性分析结果

3-0.28312-0.08020-0.3057-0.40416-0.603 a24-0.516峰号r值峰号r值峰号r值1-0.38810-0.27718-0.3032-0.23211-0.27419-0.2484-0.55313-0.03221-0.4825-0.10814-0.24822-0.4096-0.38915-0.18823-0.4308-0.32017-0.08925-0.4899-0.129

aP<0.05。

综上所述,峰4(菊苣酸)、峰7、峰8、峰16(大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷)、峰18、峰21为灰色关联度分析和Pearson相关性分析的交集,结合PLS模型中VIP值交集,筛选出与DPPH氧化活性药效关联度最高的峰为峰4(菊苣酸)和峰16(大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷),推测其为和胃降逆胶囊潜在的抗氧化Q-Marker。

3 讨论

本研究在建立HPLC指纹图谱时,对不同流动相(甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%甲酸水)进行了考察,发现乙腈-0.1%甲酸水为流动相时,供试品色谱图的基线较平稳,分离效果好且峰形最佳,故最终以乙腈-0.1%甲酸水为流动相;在考察检测波长(210、250、290、360 nm)时,发现250 nm波长处色谱峰较多,且吸收较高;考察色谱柱在15、20、25、30、35 ℃下的分离效果,发现20 ℃时分离效果好,最终将柱温设为20 ℃。同时也考察了不同提取溶剂(甲醇、乙醇、水)、不同提取溶剂比例(50%、60%、70%、80%、90%、100%)、不同提取时间(15、30、45、60 min),最终确定,取和胃降逆胶囊1.0 g,使用70%甲醇50 ml,超声提取45 min作为提取条件。

谱效关系是中药药效物质基础的重要手段。灰色关联度分析是对多批次色谱峰数值及药效数值进行关联,其值均为正值,只能反映成分与药效相关性大小,不能全面反映药效正负关系,即不能正确地分析化学成分对药效的综合贡献。PLS可直观地分析图谱中各特征峰对药效的综合贡献,其回归系数更容易解释和分析,可以很好地弥补灰色关联度分析的不足[14-15]。在实际分析时,很多学者在谱效学的研究中更趋向于采用2种及以上的分析方法联合应用[16-17]

本研究以DPPH自由基的清除率为抗氧化活性的药效学指标,分析了11批和胃降逆胶囊的抗氧化活性。结果显示,11批和胃降逆胶囊均具有抗氧化能力。本研究运用灰色关联度分析、PLS、Pearson相关性分析3种模式识别方法,建立了和胃降逆胶囊HPLC指纹图谱和抗氧化活性之间的关系,保证了结果的可靠性。灰色关联度分析结果显示,25个共有峰与DPPH氧化活性的关联度均 ≥0.543,提示和胃降逆胶囊体外抗氧化作用是多成分协同作用的结果;PLS分析结果显示,峰16(大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷)、峰19、峰12、峰24、峰4(菊苣酸)、峰9、峰1和峰25(大黄素)对和胃降逆胶囊清除DPPH自由基的能力影响较大;Pearson相关性分析结果显示,峰1、峰4(菊苣酸)、峰6、峰7、峰8、峰16(大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷)、峰18、峰20、峰21、峰22、峰23、峰24和峰25(大黄素)与和胃降逆胶囊清除DPPH自由基的能力相关性较大。通过筛选,3种分析方法下与清除DPPH自由基的能力关联度均较高的是峰4(菊苣酸)和峰16(大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷),提示这两个峰对应的化学成分含量增加时,和胃降逆胶囊的抗氧化活性会显著增强。

本研究采用HPLC建立了测定和胃降逆胶囊指纹图谱方法,确定了指纹图谱中25个共有峰,并对其中5个共有峰进行指认。采用DPPH法考察和胃降逆胶囊的抗氧化活性,运用灰色关联度分析、PLS、Pearson相关性分析研究特征峰与抗氧化活性之间的谱效关系,筛选出和胃降逆胶囊抗氧化活性成分群为峰4(菊苣酸)和峰16(大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷)。本研究建立的谱-效关系可为和胃降逆胶囊的抗氧化物质基础研究提供参考,初步辨识了潜在抗氧化Q-Marker,为和胃降逆胶囊的质量控制与评价提供了依据。

利益冲突声明:所有作者均声明不存在利益冲突。

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Research on quality markers of Hewei Jiangni Capsules based on HPLC fingerprint and antioxidant spectrum-activity relationship

LI Shasha1 ZHAO Zongping2 CAI Mengmeng2 MAO Ajuan1 LI Fang1 LI Fan1 WANG Weifeng1

1.Institute of Chinese Materia Medica, Shaanxi Academy of Traditional Chinese Medicine, Shaanxi Province, Xi’an 710003, China; 2.Shaanxi Weixin Pharmaceutical Co., Ltd. Shaanxi Province, Xi’an 710065, China

[Abstract] Objective To establish the HPLC fingerprint of Hewei Jiangni Capsules, and preliminarily investigate the antioxidant activity of Hewei Jiangni Capsules. Methods Using the Similarity Evaluation System of Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System of Traditional Chinese Medicine (2012 Edition) to establish the HPLC fingerprint of Hewei Jiangni Capsules and perform the similarity evaluation, and the common peaks were determined. The antioxidant activity of Hewei Jiangni Capsules was investigated by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging experiment. The grey relational degree analysis, partial least squares regression analysis (PLS), and Pearson correlation analysis were used to analyze the spectrum-activity relationship between the HPLC fingerprint of Hewei Jiangni Capsules and their antioxidant activity. Results In this study, the fingerprint of 11 batches of Hewei Jiangni Capsules were established, with a similarity of all>0.900. A total of 25 common peaks were identified, among which five were identified, namely chlorogenic acid, chicoric acid, polydatin, physcion 8-O-β-D-glucoside, and physcion. The halfmaximal inhibitory concentration (IC50) of the DPPH free radical scavenging experiment was 0.409-0.799 mg/ml. The results of the grey relational degree analysis showed that the r value of the DPPH free radical scavenging rate by the 16 common peaks was greater than 0.70. The results of PLS and Pearson correlation analysis showed that the correlation coefficients and regression coefficients of peak 4 and peak 16 were negatively correlated with the IC50 value of the DPPH free radical scavenging rate, and the variable importance in projection was greater than 1. Conclusion All 11 batches of Hewei Jiangni Capsules have good antioxidant activity, and their antioxidant effect is the result of the synergistic action of the internal antioxidant component group. The components corresponding to common peaks 4 and 16 are closely related to their antioxidant activity and are the main active ingredients of antioxidant activity, revealing the pharmacodynamic material basis of the antioxidant activity of Hewei Jiangni Capsules, which provide reference for the further study on quality markers.

[Key words] Hewei Jiangni Capsules; Antioxidant; Fingerprint; Spectrum-activity relationship; Quality markers

[中图分类号] R284.1

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210(2026)07(c)-0021-07

DOI:10.20047/j.issn1673-7210.25111922

[基金项目] 陕西省重点研发计划项目(2024SF-YBXM-481)。

[作者简介]

李莎莎(1988-),女,硕士,主要从事中药新药研究工作。

[通讯作者] 王卫锋(1968-),男,硕士,主任药师,主要从事中药新药研究工作。

(收稿日期:2025-11-24)

(修回日期:2026-03-09)

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