DOI:10.20047/j.issn1673-7210.25111922
中图分类号:R284.1
李莎莎1, 赵宗平2, 蔡萌萌2, 毛阿娟1, 李芳1, 李凡1, 王卫锋1
| 【作者机构】 | 1陕西省中医药研究院中药研究所; 2陕西威信制药有限公司 |
| 【分 类 号】 | R284.1 |
| 【基 金】 | 陕西省重点研发计划项目(2024SF-YBXM-481)。 |
慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)是胃癌发展过程中的关键环节。在CAG发生、发展中,常伴随氧化应激平衡(氧化/抗氧化失调)的持续破坏,由慢性炎症引发的氧化应激主要源自免疫细胞和胃黏膜细胞,是诱发细胞DNA损伤、凋亡及癌变的关键因素[1-2]。
和胃降逆胶囊组方源自毛水龙先生的经验方,由朱砂七、太白楤木、老龙皮、天仙藤、煅赭石和蒲公英6味中药组成,具有活血理气、清热化瘀、和胃降逆的功效[3]。现代研究表明,和胃降逆胶囊能够显著改善CAG患者的临床症状、胃镜下胃黏膜征象及胃黏膜萎缩状态[4-5]。然而,该药改善CAG胃黏膜组织是否与清除体内过量过氧化物有关尚不明确。目前,和胃降逆胶囊研究主要集中在工艺、质量控制和肿瘤相关药理学方面[6-9];而关于质量标志物(quality markers,Q-Marker)的研究属于空白,且具体是哪些成分发挥抗氧化作用尚未明确。基于此,本研究通过灰色关联度分析、偏最小二乘回归分析(partial least squares,PLS)、Pearson相关性分析与和胃降逆胶囊HPLC指纹图谱、体外抗氧化活性之间的关联性,初步探讨其体外发挥抗氧化作用的物质基础,以期为和胃降逆胶囊Q-Marker的确定提供数据支撑。
高效液相色谱仪(型号:LC-2010型,日本岛津公司);酶标仪(型号:Multiskan Sky型,美国赛默飞世尔科技公司);粉碎机(型号:DFT-200A型,温岭市林大机械有限公司);超声波清洗器(型号:KQ-5200E型,昆山市超声仪器有限公司);电子分析天平(型号:BS210S型万分之一和BT25S型十万分之一,北京赛多利斯科学仪器有限公司)。
大黄素对照品(含量以96.0%计,批号:110756-201913)、绿原酸对照品(含量以96.3%计,批号:110753-202119)、菊苣酸对照品(含量以98.7%计,批号:111752-202105)、虎杖苷对照品(含量以87.3%计,批号:111575-201603)均购自中国食品药品检定研究院;大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品(含量 ≥98.0%,批号:CHB250522)购自成都克洛玛生物科技有限公司;抗坏血酸对照品(批号:20250507)购自天津市大茂化学试剂合伙企业;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)(批号:C12555134)购自德国默克公司;甲醇、乙腈和甲酸为色谱级;其他试剂均为分析纯;水为娃哈哈纯净水。
和胃降逆胶囊(每粒装0.4 g,有效期30个月)共11批,编号为S1~S11,批号分别为190501、190502、190503、210201、210501、211101、211102、211103、220301、220401、230801,由陕西威信制药有限公司生产。
2.1.1 对照品储备液
取虎杖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、绿原酸、菊苣酸和大黄素对照品适量,精密称定,分别置于不同10 ml量瓶中,加甲醇定容,得到对照品母液;精密量取各母液适量置于同一10 ml量瓶中,甲醇定容,配制成质量浓度分别为0.205 8、0.185 2、0.110 4、0.205 0、0.185 4 mg/ml的混合对照品,备用。
2.1.2 供试品溶液
精密称定和胃降逆胶囊内容物1.0 g,置于具塞三角瓶中,加入70%甲醇50 ml,称量,超声处理45 min,放凉至室温,用70%甲醇补足减失的量,0.22 μm微孔滤膜滤过,即得样品溶液A。将部分样品溶液A加70%甲醇稀释,配制成不同质量浓度(0.023 4、0.046 9、0.093 8、0.187 5、0.375 0、0.750 0、1.500 0 mg/ml)的样品溶液B。样品溶液A用于指纹图谱的建立,样品溶液B用于DPPH自由基清除实验。
2.1.3 抗坏血酸阳性对照溶液
精密称取抗坏血酸适量,置于5 ml容量瓶中,加70%乙醇溶解并定容,摇匀,即得阳性对照溶液[10-11]。后续实验根据需要浓度,取一定量定容至10 ml容量瓶中,配制成不同浓度的抗坏血酸阳性对照溶液。
2.1.4 DPPH自由基溶液
精密称取DPPH适量,置于100 ml容量瓶中,加70%乙醇溶解并定容,摇匀,即得0.2 mmol/L的自由基溶液[10-11]。
2.2.1 色谱条件
色谱柱为AGILENT Poroshell 120 EC-C18(150 mm× 4.6 mm,4 μm),以0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相,梯度洗脱。洗脱程序为:0~5 min,10%B→18%B;5~35 min,18%B→25%B;35~50 min,25%B→30%B;50~80 min,30%B→80%B;80~85 min,80%B→10%B;85~90 min,10%B。流速为0.3 ml/min,柱温为20 ℃,检测波长为250 nm,进样量为10 μl。
2.2.2 方法学考察
2.2.2.1 精密度 按照“2.2.1”项下色谱条件,将“2.1.2”项下样品溶液A(编号:S1)连续进样测定6次,记录各共有峰的保留时间和峰面积,以8号色谱峰的保留时间和峰面积为参照,计算各共谱峰相对保留时间的RSD值均 ≤0.58%、相对峰面积的RSD值均 ≤3.02%,提示仪器的精密度良好,符合指纹图谱的技术要求。
2.2.2.2 稳定性 按照“2.2.1”项下色谱条件,将分别于室温放置0、2、4、6、8、10、12、24 h的样品溶液A(编号:S1)进样测定,以8号色谱峰保留时间和色谱峰面积为参照,计算各色谱峰的相对保留时间的RSD值 ≤0.46%,相对峰面积的RSD值 ≤3.38%,提示样品溶液在室温放置24 h内稳定性良好。
2.2.2.3 重复性 按照“2.1.2”项下方法制备同一批次(编号:S1)供试品溶液6份,按照“2.2.1”项下色谱条件进样测定,以8号色谱峰的保留时间和色谱峰面积为参照,计算各色谱峰相对保留时间的RSD值 ≤0.45%,相对峰面积的RSD值 ≤3.34%,提示本方法重复性良好。
2.2.3 指纹图谱的生成和共有峰的指认
取11批和胃降逆胶囊样品,按照“2.1.2”项下方法制备样品溶液A,“2.2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)》,以S1样品的色谱图为参照图谱,时间窗宽度为0.1,以平均数法生成叠加指纹图谱,通过多点校正,经Mark峰匹配后生成对照图谱R。通过对比混合对照品溶液,进行色谱峰的识别和指认,共标定25个共有峰,并指认出其中5个共有峰:峰3为绿原酸、峰4为菊苣酸、峰5为虎杖苷、峰16为大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、峰25为大黄素。见图1、图2。
图1 11批和胃降逆胶囊的指纹图谱叠加图
图2 混合对照品的HPLC图谱
2.2.4 相似度评价
采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)》对11批样品进行相似度评价,结果显示,11批样品与对照指纹图谱R的相似度分别为0.988、0.989、0.994、0.973、0.995、0.983、0.995、0.997、0.989、0.980、0.988,提示11批样品化学成分组成具有较好的一致性。
取“2.1.3”项下阳性对照溶液、“2.1.2”项下系列样品溶液B各100 μl,加至96微孔板中,再加入“2.1.4”项下DPPH自由基溶液100 μl,避光反应30 min后,使用酶标仪于517 nm波长处测光密度值。
按照公式计算DPPH自由基清除率,计算公式为:清除率=[1-(A2-A1)/A0]×100%,A2为样品光密度值(样品溶液+DPPH自由基溶液);A1为样品本底光密度值(样品溶液+70%甲醇溶液);A0为空白对照光密度值(70%甲醇溶液+DPPH自由基溶液);平行测定3次。同法处理抗坏血酸阳性对照溶液,计算各样品的半数抑制浓度(IC50)。结果显示,抗坏血酸的IC50值为0.492 μg/ml,11批样品均具有清除DPPH自由基的能力;基于IC50值,对样品的DPPH自由基清除能力进行由大到小排序,即S4、S3、S2、S8、S11、S7、S10、S5、S6、S1、S9。见表1。
表1 和胃降逆胶囊的体外抗氧化活性测定结果![]()
编号DPPH IC50编号DPPH IC50编号DPPH IC50 S10.628±0.033S50.525±0.019S90.799±0.017 S20.459±0.016S60.552±0.026S100.515±0.010 S30.416±0.004 S70.506±0.011S110.484±0.013 S40.409±0.044S80.472±0.012
注 DPPH:1,1-二苯基-2-三硝基苯肼;IC50:半数抑制浓度。
采用均值化对峰面积和表1数据进行无量纲化处理,以DPPH自由基清除率试验的IC50值为参考序列,25个共有峰的峰面积为比较序列,分辨系数p为0.5,计算二者之间的关联度(r),并对其进行排序,结果见表2。通过r可初步确定所对应化学成分与抗氧化活性之间的关系,r值越大,说明化学成分与抗氧化作用的关联性越大,反之则越小[12]。结果显示,25个共有峰的r值均 ≥0.543,提示和胃降逆胶囊的体外抗氧化作用是多成分协同作用的结果。根据r值的大小,确定共有峰对体外抗氧化活性的贡献大小顺序为:峰11>峰18>峰19>峰16(大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷)>峰5(虎杖苷)>峰13>峰8>峰7>峰15>峰14>峰9>峰21>峰4(菊苣酸)>峰10>峰17>峰3(绿原酸)>峰1>峰25(大黄素)>峰2>峰24>峰23>峰12>峰22>峰6>峰20。其中,16个共有峰对DPPH自由基的清除率的r值>0.70,表现出强关联性。
表2 各共有峰与DPPH的关联度
40.74013130.7706210.7421250.7785140.75410220.6182390.74611峰号关联度关联序峰号关联度关联序峰号关联度关联序10.69317100.73714180.798220.65719110.8141190.793330.72916120.62422200.5432560.55624150.7549230.6402170.7638160.7894240.6402080.7667170.73015250.67418
注 DPPH:1,1-二苯基-2-三硝基苯肼。
将11批和胃降逆胶囊HPLC指纹图谱中25个共有峰的峰面积和DPPH自由基清除率实验的IC50值导入SIMCA 14.1软件进行PLS模型拟合分析,以峰面积为自变量(X),IC50值为因变量(Y),得到回归方程Y=-0.060 290X1+0.021 945X2+0.004 631X3-0.171 820X4-0.099 360X5-0.047 200X6-0.064 310X7+0.001 616X8+0.123 839X9+0.066 989X10-0.040 090X11+0.199 126X12+0.007 966X13+0.065 450X14-0.007 640X15-0.256 750X16-0.001 200X17-0.005 170X18-0.270 030X19+0.068 526X20-0.116 810X21-0.069 120X22-0.094 490X23-0.183 300X24-0.094 550X25;回归方程中回归系数为正值说明其与自由基清除率呈正相关,负值则表示与自由基清除率呈负相关。
由图3可知,共有9个共有峰回归系数为正值,即与DPPH自由基清除率的IC50值呈正相关,相关性大小依次为:峰12、峰9、峰20、峰10、峰14、峰2、峰13、峰3(绿原酸)和峰8;16个共有峰与DPPH自由基清除率IC50值呈负相关,相关性大小依次为:峰19、峰16(大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷)、峰24、峰4(菊苣酸)、峰21、峰5(虎杖苷)、峰25(大黄素)、峰23、峰22、峰7、峰1、峰6、峰11、峰15、峰18和峰17。
图3 标准化回归系数
变量投影重要性(variable importance in projection,VIP)值是PLS分析中的一个重要指标,VIP值越大,说明自变量X的解释能力越强,VIP值>1,则说明该活性成分与药效呈显著相关[13]。由图4可知,VIP值>1的特征峰有8个,分别为峰16(大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷)、峰19、峰12、峰24、峰4(菊苣酸)、峰9、峰1和峰25(大黄素),其中峰16的VIP值最大,提示大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷对和胃降逆胶囊抗氧化作用的贡献最大。
图4 VIP值得分图
对11批和胃降逆胶囊HPLC指纹图谱中25个共有峰的峰面积与DPPH自由基清除实验的IC50值进行Z-Score标准化处理,采用Pearson相关性分析对二者之间的谱效关系进行研究。结果显示,峰1、峰4(菊苣酸)、峰6、峰7、峰8、峰16(大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷)、峰18、峰20、峰21、峰22、峰23、峰24和峰25(大黄素)与DPPH自由基清除率的IC50值的r值<-0.300;峰16(大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷)的峰面积与DPPH自由基清除实验的IC50呈负相关(r=-0.603,P<0.05),推测上述相关色谱峰对应的有效成分含量增高时,其清除自由基的IC50值变小,即自由基的清除能力增强。见表3。
表3 Pearson相关性分析结果
3-0.28312-0.08020-0.3057-0.40416-0.603 a24-0.516峰号r值峰号r值峰号r值1-0.38810-0.27718-0.3032-0.23211-0.27419-0.2484-0.55313-0.03221-0.4825-0.10814-0.24822-0.4096-0.38915-0.18823-0.4308-0.32017-0.08925-0.4899-0.129
注 aP<0.05。
综上所述,峰4(菊苣酸)、峰7、峰8、峰16(大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷)、峰18、峰21为灰色关联度分析和Pearson相关性分析的交集,结合PLS模型中VIP值交集,筛选出与DPPH氧化活性药效关联度最高的峰为峰4(菊苣酸)和峰16(大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷),推测其为和胃降逆胶囊潜在的抗氧化Q-Marker。
本研究在建立HPLC指纹图谱时,对不同流动相(甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%甲酸水)进行了考察,发现乙腈-0.1%甲酸水为流动相时,供试品色谱图的基线较平稳,分离效果好且峰形最佳,故最终以乙腈-0.1%甲酸水为流动相;在考察检测波长(210、250、290、360 nm)时,发现250 nm波长处色谱峰较多,且吸收较高;考察色谱柱在15、20、25、30、35 ℃下的分离效果,发现20 ℃时分离效果好,最终将柱温设为20 ℃。同时也考察了不同提取溶剂(甲醇、乙醇、水)、不同提取溶剂比例(50%、60%、70%、80%、90%、100%)、不同提取时间(15、30、45、60 min),最终确定,取和胃降逆胶囊1.0 g,使用70%甲醇50 ml,超声提取45 min作为提取条件。
谱效关系是中药药效物质基础的重要手段。灰色关联度分析是对多批次色谱峰数值及药效数值进行关联,其值均为正值,只能反映成分与药效相关性大小,不能全面反映药效正负关系,即不能正确地分析化学成分对药效的综合贡献。PLS可直观地分析图谱中各特征峰对药效的综合贡献,其回归系数更容易解释和分析,可以很好地弥补灰色关联度分析的不足[14-15]。在实际分析时,很多学者在谱效学的研究中更趋向于采用2种及以上的分析方法联合应用[16-17]。
本研究以DPPH自由基的清除率为抗氧化活性的药效学指标,分析了11批和胃降逆胶囊的抗氧化活性。结果显示,11批和胃降逆胶囊均具有抗氧化能力。本研究运用灰色关联度分析、PLS、Pearson相关性分析3种模式识别方法,建立了和胃降逆胶囊HPLC指纹图谱和抗氧化活性之间的关系,保证了结果的可靠性。灰色关联度分析结果显示,25个共有峰与DPPH氧化活性的关联度均 ≥0.543,提示和胃降逆胶囊体外抗氧化作用是多成分协同作用的结果;PLS分析结果显示,峰16(大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷)、峰19、峰12、峰24、峰4(菊苣酸)、峰9、峰1和峰25(大黄素)对和胃降逆胶囊清除DPPH自由基的能力影响较大;Pearson相关性分析结果显示,峰1、峰4(菊苣酸)、峰6、峰7、峰8、峰16(大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷)、峰18、峰20、峰21、峰22、峰23、峰24和峰25(大黄素)与和胃降逆胶囊清除DPPH自由基的能力相关性较大。通过筛选,3种分析方法下与清除DPPH自由基的能力关联度均较高的是峰4(菊苣酸)和峰16(大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷),提示这两个峰对应的化学成分含量增加时,和胃降逆胶囊的抗氧化活性会显著增强。
本研究采用HPLC建立了测定和胃降逆胶囊指纹图谱方法,确定了指纹图谱中25个共有峰,并对其中5个共有峰进行指认。采用DPPH法考察和胃降逆胶囊的抗氧化活性,运用灰色关联度分析、PLS、Pearson相关性分析研究特征峰与抗氧化活性之间的谱效关系,筛选出和胃降逆胶囊抗氧化活性成分群为峰4(菊苣酸)和峰16(大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷)。本研究建立的谱-效关系可为和胃降逆胶囊的抗氧化物质基础研究提供参考,初步辨识了潜在抗氧化Q-Marker,为和胃降逆胶囊的质量控制与评价提供了依据。
利益冲突声明:所有作者均声明不存在利益冲突。
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Research on quality markers of Hewei Jiangni Capsules based on HPLC fingerprint and antioxidant spectrum-activity relationship
李莎莎(1988-),女,硕士,主要从事中药新药研究工作。
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