膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）作为一种常见的退行性关节疾病，其疼痛与功能障碍严重影响患者生活质量，且随着老龄化加剧，发病率持续上升[1-4]。目前常规疗法（如非甾体抗炎药、物理治疗、关节腔注射）多仅能缓解症状，难以逆转关节退变[5-6]。中医外治法如针刀疗法，通过松解软组织、调节局部状态，在KOA治疗中展现出独特优势[7-10]。针刀疗法不仅能缓解疼痛、改善关节功能，还具有促进软骨修复、减少炎症反应的临床应用潜力[11]。本团队基于“阴急阳缓”理论提出的“调和阴阳针刀法”，前期临床研究证实，其能有效缓解疼痛、改善关节功能[12]；但深层作用机制尚未明确。

近年来研究表明，细胞焦亡是KOA软骨退变的核心病理环节之一[13-14]。NLRP3炎症小体被激活后，可切割Caspase-1，进而剪切消皮素D（gasdermin D，GSDMD）并释放白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等炎症介质，导致细胞裂解和炎症放大，加速软骨破坏[15-16]。因此，调控该通路可能成为KOA的治疗新靶点。

基于此，本研究提出假说：调和阴阳针刀的治疗效应可能与抑制NLRP3/Caspase-1介导的细胞焦亡通路有关。为此，本研究将通过动物实验，观察该疗法对KOA模型大鼠膝关节功能及焦亡关键分子（NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β）表达的影响，旨在从细胞焦亡视角阐明其作用机制，为该疗法的临床应用提供实验依据。

1 对象与方法

1.1 实验动物

选用6月龄健康SPF级SD大鼠40只，雌雄各半，体质量（200±20）g。实验动物由广州中医药大学实验动物中心提供，实验动物合格证号：44005800014423，实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2023-0034，实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2023-0092。大鼠均饲养于广州中医药大学动物实验中心SPF级动物房内，采用分笼饲养方式。饲养环境：室温（24±2）℃，湿度（50±5）%，光照周期12 h/12 h（昼夜交替）。所有大鼠可自由摄食饮水，实验开始前，均进行为期1周的适应性饲养。实验严格遵守广州中医药大学发布的《实验室安全管理规定》中相关动物伦理要求。本研究方案已通过广州中医药大学第一附属医院实验动物伦理委员会审批（GZTCMF1-20230015）。

1.2 主要仪器与试剂

0.35 mm×40 mm一次性小针刀（苏州医疗用品厂有限公司，批号：222384）；转棒仪（上海吉量软件科技有限公司，型号：DigBehv-RRTR）；多功能酶标仪（江苏东华电子股份有限公司，型号：DG5033A）；高速离心机（美国Sciilogex LLC公司，型号：D3024R）；荧光定量PCR仪（德国Analytik Jena AG公司，型号：Qtower3G）。

木瓜蛋白酶（美国Sigma-Aldrich公司，批号：SLCD866）；L-半胱氨酸（美国Sigma-Aldrich公司，批号：STBJ3975）；戊巴比妥钠粉剂（国药集团化学试剂有限公司，批号：WS20200401）；塞来昔布（辉瑞制药有限公司，批号：J20140072）；NLRP3、Caspase-1抗体（奥菲生物技术有限公司，货号：DF7438、AF4005）；NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒（江苏酶免实业有限公司，货号：MM-1028R1、MM-70164R1、MM-2074R1、MM-0047R1）；Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（美国Southern Biotech公司，货号：4050-05）；SYBR Green Realtime PCR Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：Q712）。

1.3 实验分组及处理

采用随机数字表法将40只大鼠分为空白组、模型组、药物组、调和阴阳针刀组（以下简称“针刀组”），每组10只大鼠，雌雄各半，并采用苦味酸与品红溶液进行双色编号标记。除空白组外，其余各组大鼠均进行KOA造模。将戊巴比妥钠粉末用无菌生理盐水配制成3%的溶液（30 mg/ml），按40 mg/kg的剂量腹腔注射，麻醉后常规备皮、消毒，采用木瓜蛋白酶法进行造模。每只大鼠双侧膝关节腔内分别注射0.2 ml木瓜蛋白酶混合液（4 g木瓜蛋白酶与0.3 g L-半胱氨酸加生理盐水配制成100 ml混合溶液），并分别于实验第1、4、7天重复注射1次，模型诱导期30 d[17]。造模第30天，从每组随机选取1只大鼠，麻醉后行膝关节DR检查记录关节腔隙数据，并对各组大鼠进行行为学测试（转棒疲劳实验+改良Lequesne MG膝关节评分），以转棒时间缩短、改良Lequesne MG评分升高及DR显示膝关节腔隙狭窄为造模成功的标准。整个造模过程中大鼠若出现足底溃烂、皮肤感染、上呼吸道感染、骨折等情况，均予以剔除。

空白组：实验期间保持常规饲养条件，不施加任何干预措施。模型组：大鼠建立KOA模型后继续常规饲养，不进行任何治疗。药物组：造模成功后开始干预，将塞来昔布以纯水溶解后灌胃给药，根据人体剂量按体质量折合为大鼠的给药剂量为10 mg/（kg·d）[18]。治疗频次为1次/d，连续给药4周。针刀组：造模成功后接受调和阴阳针刀治疗，具体操作如下：①将大鼠麻醉后，通过触诊分别探寻内侧、外侧副韧带周围的异常应力点，酌情选择4个点并做好标记。②术区常规备皮消毒。③外侧副韧带附近治疗点，手法幅度宜小，持针刀垂直刺入皮肤，直达骨面，刀口线应与肌肉纤维走向平行，而后行纵行疏通1次，切口范围约1 mm，然后调转刀口线朝向目标高应力点施以“冲法”1次，针身移动距离控制在1 mm，然后横向剥离1次，剥离范围30°～45°。④内侧副韧带附近治疗点，手法幅度宜大，操作同前进针后，行纵行疏通1次，切口范围约1.5 mm，然后调转刀口线朝向目标高应力点施以“冲法”1次，针身移动距离控制在2 mm，然后横向剥离1次，剥离范围60°～90°。⑤术毕出针按压止血2 min。治疗频次为1次/周，共治疗4周。

1.4 样本处理

治疗结束后，各组大鼠评估改良Lequesne MG膝关节评分并进行转棒疲劳实验，之后将各组大鼠麻醉行膝关节DR检查并记录关节腔隙数据。处死各组大鼠，腹主动脉取血，4 ℃、9 000 g离心20 min（离心半径100 mm），取血清备用；依次切开右膝关节皮肤，分离肌肉、肌腱，切断髌韧带，充分暴露膝关节结构后，取股骨内外侧髁处的软骨，大小约2 mm×2 mm。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 转棒疲劳实验 在造模开始前，所有大鼠均于转棒仪上进行预适应训练，以确保其具备稳定的爬行能力。造模成功后，分别于治疗前后对各组大鼠进行转棒疲劳实验，将转棒仪转速设定为30 r/min，依次将各组大鼠置于仪器上，记录转棒停留时间。

1.5.2 改良LequesneMG膝关节评分 造模成功后，分别于治疗前后，评价各组大鼠改良Lequesne MG膝关节评分，评价内容：①疼痛刺激（无疼痛记0分，患肢收缩记1分，患肢收缩、轻度全身反应记2分，乱窜、挣扎记3分）；②步态（无跛行记0分，轻度跛行记1分，跛行明显记2分，患肢不参与行走记3分）；③关节活动度（＞90°记0分，45°～90°记1分，＞45°～15°记2分，＜15°记3分）；④关节肿胀（无肿胀记0分，轻度肿胀记1分，重度肿胀记2分）。

1.5.3 影像学DR检测膝关节腔隙 治疗结束后，各组随机取3只大鼠拍摄双膝关节蛙位DR片，采集膝关节区影像数据，测量双侧膝关节腔隙宽度并记录。

1.5.4 免疫组织化学法检测膝关节软骨组织中NLRP3、Caspase-1表达 膝关节软骨组织标本经3%甲醛固定、石蜡包埋、切片，常规脱蜡水化，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，对NLRP3、Caspase-1蛋白用苏木精行免疫组织化学染色，封片后光学显微镜下观察阳性表达（棕色信号）。

1.5.5 ELISA法检测血清NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β含量 取血清按ELISA试剂盒说明书操作，检测NLRP3、Caspase-1、GSDMD及IL-1β含量。

1.5.6 Western blot法检测膝关节软骨Caspase-1、NLRP3蛋白表达 膝关节软骨组织经PBS清洗，液氮研磨后超声粉碎制成匀浆，取上清液置于Page胶孔中，每孔加入约15 μl组织清液，使用120 V稳定电流电泳约2 h、250 V稳定电压转膜约3 h、PBS+5%脱脂乳制作封闭液室温封闭1 h，TBST洗涤后加一抗（NLRP3、Caspase-1，稀释均1∶1 000）4 ℃孵育过夜；TBST洗涤，加入HRP标记二抗[Goat Anti－Rabbit IgG（H+L），稀释1∶5 000]室温孵育2 h，ECL显影，分析NLRP3、Caspase-1蛋白表达。

1.5.7 RT-qPCR法检测膝关节软骨Caspase-1、NLRP3 mRNA表达 取膝关节软骨组织匀浆，Trizol法提取RNA，反转录成cDNA。采用SYBR Green法进行RT-qPCR检测，反应体系总体积为10 μl：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 5.0 μl，cDNA 2.0 μl，正向引物0.4 μl，反向引物0.4 μl，RNase-Free water 2.2 μl。扩增条件：50 ℃反应2 min，95 ℃反应2 min，95 ℃反应15 s+60 ℃反应1 min（40个循环），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。NLRP3引物序列：正向引物5’- GTGTCAAGACCACAGCTCCA-3’，反向引物5’-ATC GGGAAAGGCAGGCTAAC-3’，产物长度147 bp；Caspase-1引物序列：正向引物5’-GCCTGGTCTTGTGATGTGGA-3’，反向引物5’-TGATAGCACTCTTGGCTTCGT-3’，产物长度159 bp；设置GAPDH为内参，GAPDH引物序列：正向引物5’-TGCACCACCAACTGCTTAG-3’，反向引物5’- GGATGCAGGGATGATGTTC-3’，产物长度177bp，结果以2-△△Ct方法计算相对表达量。

1.6 统计学方法

采用SPSS 24.0统计学软件进行数据分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，两组间比较采用独立样本t检验。多组间比较方差齐时采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；方差不齐时采用非参数秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物数量分析

实验过程中无大鼠死亡，40只大鼠的相关数据均纳入统计分析。

2.2 各组治疗前后转棒疲劳实验、改良Lequesne MG膝关节评分比较

针刀组治疗后转棒停留时间长于治疗前，改良Lequesne MG评分低于治疗前（P＜0.05）。治疗前后，与空白组比较，模型组转棒停留时间缩短，改良Lequesne MG评分升高（P＜0.05）；与模型组比较，针刀组治疗后转棒停留时间延长，改良Lequesne MG评分降低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组治疗前后转棒疲劳实验、改良Lequnesne MG评分比较

组别只数改良Lequesne MG评分（分）治疗前治疗后治疗前治疗后空白组1023.70±5.3924.60±2.110.000.00针刀组109.40±3.5920.00±3.19ac8.00±0.942.90±0.99ac药物组1010.20±3.1515.00±2.358.20±1.034.80±0.78转棒停留时间（s）模型组109.60±4.27b9.80±2.25b7.90±1.10b8.20±0.63b

注 与本组治疗前比较，aP＜0.05；与空白组同期比较，bP＜0.05；与模型组同期比较，cP＜0.05。

2.3 各组膝关节腔隙比较

与空白组比较，模型组膝关节腔隙缩小（P＜0.05）；与模型组比较，针刀组膝关节腔隙增大（P＜0.05）。见图1。

图1 各组膝关节腔隙比较

2.4 各组膝关节软骨组织NLRP3、Caspase-1表达比较

与空白组比较，模型组膝关节软骨组织NLRP3、Caspase-1阳性面积占比升高（P＜0.05）；与模型组比较，针刀组膝关节软骨组织NLRP3、Caspase-1阳性面积占比降低（P＜0.05）。见图2、图3。

图2 各组测膝关节软骨组织NLRP3表达比较

图3 各组膝关节软骨组织Caspase-1表达比较

2.5 各组血清Caspase-1、NLRP3、GSDMD、IL-1β含量比较

与空白组比较，模型组血清Caspase-1、NLRP3、GSDMD、IL-1β含量升高（P＜0.05）；与模型组比较，针刀组血清Caspase-1、NLRP3、GSDMD、IL-1β含量降低（P＜0.05）。见图4。

图4 各组血清Caspase-1、NLRP3、GSDMD、IL-1β含量比较（n=10）

2.6 各组膝关节软骨组织Caspase-1、NLRP3蛋白表达比较

与空白组比较，模型组Caspase-1、NLRP3蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，针刀组Caspase-1、NLRP3蛋白表达水平降低（P＜0.05）。见图5。

图5 各组膝关节软骨组织Caspase-1、NLRP3蛋白表达比较

2.7 各组膝关节软骨组织Caspase-1、NLRP3 mRNA表 达比较

与空白组比较，模型组Caspase-1、NLRP3 mRNA表达水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，针刀组Caspase-1、NLRP3 mRNA表达水平降低（P＜0.05）。见图6。

图6 各组膝关节软骨组织Caspase-1、NLRP3 mRNA表达比较（n=10）

3 讨论

本研究结果显示，调和阴阳针刀能有效改善KOA模型大鼠的关节功能与结构，并从细胞焦亡视角初步揭示了其“调筋治骨”的分子机制，即抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD/IL-1β信号轴。

KOA属中医“筋痹”，核心为“筋骨失衡”。本团队提出“阴急阳缓”病机新解，认为膝内侧（阴经筋）拘急与外侧（阳经筋）弛缓并存，这与膝关节内翻、力线异常的现代认识一致[19]。调和阴阳针刀据此创新，在传统松解的基础上，于内侧施重手法“泻阴”，外侧施轻手法“补阳”，旨在恢复力学平衡[20]。前期临床研究已验证其能缓解疼痛、改善功能并纠正足底力线[12]。本研究采用木瓜蛋白酶-L-半胱氨酸关节腔注射法成功构建大鼠KOA模型。结果显示，针刀干预不仅能逆转模型大鼠的运动功能障碍，更能增大DR影像上已缩窄的膝关节腔隙。这一结构性改善提示，该疗法可能通过纠正力学失衡，为关节修复创造了条件[21]。

KOA病理机制复杂，涉及炎症、凋亡、自噬及焦亡等多重过程[22]。本研究的核心发现在于，将针刀的力学调节效应与“抑制细胞焦亡”这一分子病理环节相链接。细胞焦亡是由NLRP3炎症小体介导的程序性炎症死亡，在KOA软骨退变中起关键作用[23-24]。其通路为：NLRP3激活Caspase-1，后者切割GSDMD和白细胞介素-1β前体（pro-interleukin-1β，pro-IL-1β），导致细胞膜穿孔、IL-1β释放，从而放大炎症、破坏软骨[25]。异常机械应力是激活NLRP3的关键始动因素。本研究结果显示，模型组软骨组织NLRP3、Caspase-1表达及血清GSDMD、IL-1β含量升高，提示焦亡通路被激活；而针刀干预能下调这些指标，这提示针刀通过“泻阴补阳”恢复膝关节力学平衡，可能从源头减少了异常机械应力对软骨细胞的刺激，从而阻断了NLRP3炎症小体的激活及其下游的焦亡级联反应。张良志等[26]研究发现，针刀可通过上调miR-140-5p抑制组织蛋白酶B（cathepsin B，CTSB），进而阻断CTSB/NLRP3轴，这为本研究现象提供了上游机制线索。此外，有研究发现，核因子κB作为上游信号可调控NLRP3的表达，其在调控焦亡中也具有重要作用，提示针刀的作用网络可能更广泛[27]。

本研究从细胞焦亡角度，将中医“筋骨失衡”理论与现代“机械应力-炎症小体-细胞焦亡”病理过程有机联结，为调和阴阳针刀的疗效提供了机制依据。本研究存在一定的局限性：机制研究聚焦于焦亡通路，未能全面涵盖KOA的其他病理途径及其交互作用；对上游信号及机械信号转导的具体机制尚未深入。未来研究应扩大样本量，并着力于利用多组学技术，系统解析针刀干预下的整体分子网络；深入阐明“力学-生物学”信号转导的精确路径；探索该疗法与其他治疗联用的协同效应。通过持续研究，有望更全面阐释其科学内涵。

作者贡献声明：潘丰盈负责研究构思，实验设计，执行实验，数据收集、汇总与统计分析，绘制图表，论文撰写、修改与投稿；林煜翔负责研究构思，实验设计，执行实验，数据收集，论文撰写；张智杰负责实验设计，执行实验，数据收集，论文撰写；谢晓红负责执行实验，数据收集；许铛瀚负责实验设计，提供研究材料、设备、样本，执行实验，数据收集；郑谅负责总体指导及最终审稿；罗孟西负责总体指导，提供研究材料、设备、样本，经费支持，指导论文修改，最终审稿。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

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Exploration of the mechanism of action of harmonizing yin-yang acupotomy in the treatment of knee osteoarthritis based on pyroptosis

PAN Fengying1 LIN Yuxiang2 ZHANG Zhijie1 XIE Xiaohong3 XU Danghan4 ZHENG Liang5 LUO Mengxi5

1.The First Clinical Medical School, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangdong Province, Guangzhou 510405, China; 2.Guangdong Peiying Vocational Technical School, Guangdong Province, Guangzhou 510663, China;3.Department of Traditional Chinese Medicine Rehabilitation and Pain Management, Affiliated Stomatological Hospital of Jinan University Daliang Hospital, Shunde District, Guangdong Province, Foshan 528300, China; 4.Huazhou Street Community Health Service Center, Guangdong Province, Guangzhou 510300, China; 5.Acupuncture, Moxibustion and Rehabilitation Center, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangdong Province,Guangzhou 510405, China

[Abstract] Objective To observe the therapeutic effect of harmonizing yin-yang acupotomy on rats with knee osteoarthritis (KOA), and to investigate whether its mechanism is associated with the regulation of the chondrocyte pyroptosis pathway. Methods Forty six-month-old healthy SD rats of SPF grade, half male and half female, were selected and divided into blank group, model group, needle-knife group, and drug group according to the random number table method,with ten rats in each group. Except for the control group,the KOA model was established by injecting a mixture of Papain-L-cysteine into the joint cavity of rats in the other groups. Both the control group and the model group were given conventional feeding without treatment; the drug group was treated with Celecoxib Suspension by gavage once a day; and the needle-knife group was treated with harmonizing yin-yang acupotomy once a week. All groups were treated for four weeks. Before and after treatment, each group underwent the rotarod retention test, the modified Lequesne MG knee joint score, and the knee joint DR examination; after treatment, the expressions of caspase-1 and NLRP3 protein and mRNA were detected by immunohistochemical staining, Western blot, and RT-qPCR; and the contents of serum caspase-1, NLRP3, gasdermin D (GSDMD), and interleukin-1β (IL-1β) were detected by enzyme-linked immunosorbent assay. Results After treatment, compared with the blank group, the rotarod retention time in the model group was shortened, the modified Lequesne MG score was increased, and the knee joint cavity was reduced (P＜0.05);compared with the model group, the rotarod retention time in the needle-knife group was prolonged, the modified Lequesne MG score was decreased, and the knee joint cavity was increased (P＜0.05). Compared with the blank group,the expressions of NLRP3 and caspase-1 positive areas proportion, protein, and mRNA in the knee cartilage tissues of the model group increased (P＜0.05); compared with the model group, the expressions of NLRP3 and caspase-1 positive areas, protein, and mRNA in the knee cartilage tissues of the needle-knife group decreased (P＜0.05). Compared with the blank group, the contents of serum caspase-1, NLRP3, GSDMD, and IL-1β in the model group increased (P＜0.05);compared with the model group, the contents of serum caspase-1, NLRP3, GSDMD, and IL-1β in the needle-knife group decreased (P＜0.05). Conclusion Harmonizing yin-yang acupotomy effectively improves knee joint function and restores joint structure in KOA model rats. Its therapeutic mechanism is associated with the suppression of the NLRP3/Caspase-1/GSDMD/IL-1β signaling axis, leading to attenuated chondrocyte pyroptosis.

[Key words] Knee osteoarthritis; Harmonizing yin-yang acupotomy; Chondrocytes; Pyroptosis; NLRP3; Caspase-1

[中图分类号] R274.9

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）07（c）-0027-07

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25101859

[基金项目] 广东省中医药局科研项目（20231124）。

[作者简介]

潘丰盈（1998.12-），女，广州中医药大学第一临床医学院2023级针灸推拿学专业在读硕士研究生；研究方向：针灸治疗痛症、神经内科疾病。

[通讯作者] 罗孟西（1988.12-），男，硕士；研究方向：针灸推拿治疗神经、脊柱相关性疾病。

（收稿日期：2025-10-27）

（修回日期：2026-03-16）