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医院中药制剂药效好、价格优惠，是药品的一种特殊补充形式，对其质量进行严格控制，是确保临床安全用药的重要前提[1-3] 。合剂是指饮片用水或其他溶剂，采用适宜方法提取制成的口服液体制剂[4] 。研究选取扶正排毒合剂、蒲公英合剂、通石合剂、凉血止痒合剂、清肺润燥合剂这5种制剂，均为云南省中医医院经正式批准并长期应用于临床的院内中药合剂。上述制剂分别具有益气扶正、清热解毒、通淋排石、清热凉血止痒、清肺润燥等功效，其临床应用已臻成熟，疗效确切，是该医院中医特色诊疗体系的重要组成部分。在确定合剂处方时，可按需添加适量的抑菌剂、乙醇及蔗糖，这使得合剂可能具备一定的抑菌性[4] 。同时，中药成分复杂，常因含有生物碱、萜类、黄酮、酚类等成分，而具有不同程度的抑菌作用[5-8] 。供试品在开展微生物限度检查之前，需进行方法适用性试验，若盲目采用常规检查方法，易出现“假阴性”现象，难以真实反映制剂的实际微生物污染状况[4] 。目前，针对上述5种医院中药制剂，现有研究主要集中在其具体病症的治疗效果及药理作用分析方面，尚未见关于这5种制剂微生物限度检查方法的相关报道[9-11] 。因此，有必要建立这5种医院中药制剂的微生物限度检查方法，同时为其他合剂类药品的微生物限度检查提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

MJ-250-Ⅱ型培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）；BPX-82型电热恒温培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；BHC-1300A2型二级生物安全柜（苏州金净净化设备科技有限公司）；HTY-302型微生物限度检验仪（杭州泰林生物技术设备有限公司）；MLS-3781L-PC型高压蒸汽灭菌器（普和希健康医疗器械有限公司）。

1.2 供试品

实验样品为凉血止痒合剂（批号：20240225）、扶正排毒合剂（批号：20220424）、蒲公英合剂（批号：20220429）、清肺润燥合剂（批号：20240150）、通石合剂（批号：20240341），规格均为100 ml/瓶，均为云南省中医医院院内制剂。

1.3 培养基

TSB液体培养基（批号：240409k10）、TSA培养基（批号：250104k10）、SDA培养基（批号：241202k10）、麦康凯琼脂（批号：230104A10）、麦康凯液体培养基（批号：241108k10）、pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：240119A20）均购自广东环凯微生物科技有限公司，均处于有效期内，且每个配制批次均已进行培养基适用性检查试验，试验结果符合规定。

1.4 试验菌株

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003] 、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104] 、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501] 、白念珠菌[CMCC（F）98001] 、黑曲霉[CMCC（F）98003] 、大肠埃希菌[CMCC（B）44102] ，以上菌株均购自中国食品药品检定研究院。

1.5 计数检查方法适用性试验

1.5.1 菌液制备取“1.4”项下的6种菌株，其中黑曲霉采用孢子悬液，并用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液进行稀释；剩余5种菌株采用TSA斜面上的新鲜培养物，并用pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液进行稀释。需氧菌总数适用性试验所用试验菌为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白念珠菌、黑曲霉，涵盖革兰阳性菌、革兰阴性菌、产芽孢细菌、酵母菌及霉菌，可全面反映需氧微生物的生长情况。霉菌和酵母菌总数适用性试验所用试验菌为白念珠菌、黑曲霉，分别为典型酵母菌与丝状真菌。控制菌检查所用试验菌为大肠埃希菌。

1.5.2 供试液制备分别取供试品扶正排毒合剂、清肺润燥合剂、蒲公英合剂、凉血止痒合剂、通石合剂10 ml至90 ml的TSB中，振摇均匀，制成1∶10供试液备用。

1.5.3 平皿法试验设置需氧菌总数试验组：取1∶10供试液分装于5支试管中，每支9.9 ml，分别加入0.1 ml浓度约104 cfu/ml的5种菌液混匀，各取1 ml注皿，倾注TSA培养基，摇匀，待凝固后倒扣放置于培养箱内，33 ℃培养3 d后计数。

霉菌和酵母菌总数试验组：取1∶10供试液分装于2支试管中，每支9.9 ml，分别加入0.1 ml浓度约为104 cfu/ml的白念珠菌菌液、黑曲霉孢子悬液混匀，各取1 ml注皿，倾注SDA培养基，摇匀，待凝固后倒扣放置于培养箱内，23 ℃培养5 d后计数。如有蔓延趋势可逐日观察。

菌液对照组：用pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液替换试验组中样品供试液，其余同试验组。

供试品对照组：用pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液替换试验组中菌液，其余同试验组。

每批样品均设置3次平行重复试验。

1.5.4 薄膜过滤法试验设置需氧菌总数试验组：分别量取1∶10供试液10 ml，加入90 ml pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液，共5份，分别加入1 ml浓度约102 cfu/ml的5种菌液混匀后采用薄膜过滤法过滤。滤毕，用pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜2次，每次100 ml。过滤完成后取出滤膜，菌面朝上贴置于相应培养基表面，33 ℃培养3 d后计数。

霉菌和酵母菌总数试验组：分别量取1∶10供试液10 ml，加入90 ml pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液，共2份，分别加入1 ml浓度约102 cfu/ml的白念珠菌菌液、黑曲霉孢子悬液混匀后采用薄膜过滤法过滤。滤毕，用pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜2次，每次100 ml。过滤完成后取出滤膜，菌面朝上贴置于相应培养基表面，23 ℃培养5 d后计数。

菌液对照组：取1 ml浓度约102 cfu/ml的相应菌液与100 ml氯化钠-蛋白胨缓冲液混匀后过滤，滤毕，用pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜2次，每次100 ml。过滤完成后取出滤膜，菌面朝上贴置于相应培养基表面，按规定条件培养。

供试品对照组：除用pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液替换试验组中的菌液外，其余操作均与试验组相同。

每批样品均设置3次平行重复试验。

1.6 控制菌检查方法（直接接种法）适用性试验

试验组：取1∶10供试液10 ml及1 ml大肠埃希菌菌液加至100 ml TSB中，33 ℃培养24 h后，取1 ml培养物接种到100 ml的麦康凯液体培养基中，43 ℃培养24 h。将其划线接种至麦康凯琼脂培养基平板上，33 ℃培养72 h观察结果。

供试品对照组：用TSB替换试验组中菌液，其余步骤同试验组。

阳性对照组：用TSB替换样品供试液，其余步骤同试验组。

阴性对照组：不加入供试品和菌液，即直接取100 ml TSB，33 ℃培养24 h，后续步骤同试验组。

每批样品均设置3次平行重复试验。

1.7 判定依据

计数方法适用性试验中，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5~2.0范围内[4] 。开展大肠埃希菌检查方法适用性试验时，若供试品对照组检出大肠埃希菌说明样品本身被大肠埃希菌污染，应对被污染的药品批次进行全面隔离，排查污染原因，采取纠正预防措施。供试品对照组若未检出大肠埃希菌，试验方可正常开展。阳性对照组和试验组应检出大肠埃希菌，阴性对照组应无菌生长，则该控制菌检查方法适用性试验有效[12] 。

2 结果

2.1 微生物计数方法适用性试验结果

采用平皿法对5种医院中药制剂开展计数方法适用性试验，由表1可知，扶正排毒合剂、清肺润燥合剂各试验菌回收比值在0.80~1.53，蒲公英合剂、凉血止痒合剂、通石合剂各试验菌回收比值在0.60~1.20，均满足微生物计数方法适用性试验要求（回收比值0.5~2.0）。

采用薄膜过滤法对5种医院中药制剂开展计数方法适用性试验，5种医院中药制剂对各试验菌的回收比值在0.80~1.38（表2），满足微生物计数方法适用性试验要求（回收比值0.5~2.0）。

2.2 控制菌检查方法适用性试验结果

5种医院中药制剂试验组、阳性对照组均显示检测结果为阳性，供试品对照组、阴性对照组的检测结果均为阴性，提示本研究5种医院中药制剂均未检测出大肠埃希菌，制剂本身未被大肠埃希菌污染且该大肠埃希菌的检测方法满足控制菌方法适用性的要求。见表3。

3 讨论

中药制剂原料多来源于天然动植物，其本身就可能携带一定量的微生物，若在生产过程中不能有效控制，极易导致产品微生物超标。方法适用性是确保微生物限度检查方法准确可靠的关键，只有方法适用性得到验证，才能保证在实际检测过程中，对药品中微生物的检测结果真实有效[13] 。因此，需充分考虑原料特性、生产工艺等因素，结合制剂特点建立可靠的微生物限度检测方法[14-19] 。

3.1 微生物计数方法适用性探索

采用平皿法开展微生物计数方法适用性试验，扶正排毒合剂、清肺润燥合剂各试验菌回收比值在0.80~1.53，符合2025年版《中华人民共和国药典》[4] 要求；蒲公英合剂、凉血止痒合剂、通石合剂部分菌株回收比值相对偏低，提示制剂具有一定抑菌作用，对平皿法计数存在轻度干扰。为进一步消除抑菌干扰，提高结果准确性，后续采用薄膜过滤法继续验证。结果显示，采用薄膜过滤法5种制剂对各试验菌的回收比值均稳定在0.80~1.38，提示通过滤膜冲洗可有效去除抑菌成分，回收效果优于平皿法。此外，对冲洗条件等关键参数进行了考察与优化，通过预实验摸索适宜的冲洗量与冲洗次数，在有效去除抑菌成分的同时，避免因过度冲洗造成微生物损失，使方法更具合理性与可靠性。在控制菌检查方面，根据2025年版《中华人民共和国药典》[4] 规定：不含药材原粉的口服液体制剂中不得检出大肠埃希菌（l g或l ml）；含脏器提取物的制剂还不得检出沙门菌（10 g或10 ml）。本研究5种医院中药制剂均为不含药材原粉且不含脏器提取物的中药口服液体制剂，故控制菌检查项目为大肠埃希菌。对大肠埃希菌进行方法适用性试验，试验组与阳性对照组均检出大肠埃希菌，供试品对照组及阴性对照组均未检出，提示所建立的控制菌检查方法专属性强、结果准确可靠。

3.2 医院中药制剂的抑菌作用

实验结果显示，蒲公英合剂对铜绿假单胞菌具有抑菌活性，与谢诗雅等[20] 在《蒲公英多酚的抑菌和抗炎活性研究》中报道的结果一致；凉血止痒合剂中赤芍、黄芩，以及通石合剂中金钱草、海金沙、萹蓄等药材的抑菌作用，亦与已有文献记载的药材抑菌特性相符[21-24] 。上述结果从实验角度展示了中药制剂抑菌性对微生物检测方法适用性的影响，明确了制剂整体抑菌作用与检测方法适配性之间的关联，可为后续同类中药制剂微生物检测方法的建立与优化提供思路与参考。

综上所述，本研究针对5种医院中药制剂所构建的微生物限度检测方法，具备简便性、准确性和可靠性，能为制剂生产单位提供一定的参考价值。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

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【作者机构】	¹昆明市食品药品检验所； ²云南省食品药品查验中心； ³云南省中医医院制剂中心
【分类号】	R927.1
【基金】	云南省药品监督管理局科技项目(2025YNYJ24)

五种医院中药制剂微生物限度检查方法适用性研究

目录

文内图表

五种医院中药制剂微生物限度检查方法适用性研究

1 材料与方法

1.1 仪器

1.2 供试品

1.3 培养基

1.4 试验菌株

1.5 计数检查方法适用性试验

1.6 控制菌检查方法（直接接种法）适用性试验

1.7 判定依据

2 结果

2.1 微生物计数方法适用性试验结果

2.2 控制菌检查方法适用性试验结果

3 讨论

3.1 微生物计数方法适用性探索

3.2 医院中药制剂的抑菌作用