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动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）病理过程中存在胆固醇蓄积和内膜层脂肪纤维斑块生成，慢性低度炎症是AS的一个重要特征，其本质是对内膜浸润性AS脂蛋白的一种保护性免疫反应[1-3] 。AS反应-滞留假说即AS-载脂蛋白（apolipoprotein，Apo）B脂蛋白[低密度脂蛋白、脂蛋白（a）及由膳食引导向血液中过量积累的乳糜微粒残余物] [4-6] 。脂质成分滞留在内皮下是AS发病的启动因子；随病程进展，发生斑块钙化及纤维帽变薄，斑块破裂/血栓形成的风险增高，终致缺血、心肌梗死或死亡[7] 。目前AS缺乏有效的靶向动脉壁治疗方式，仅依靠危险因素的控制。

免疫疗法可通过直击动脉壁发挥作用，单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）具有高特异性、低毒副作用和临床应用优势[8] 。目前市售的AS相关mAb多集中于抗炎或调脂领域，如针对白细胞介素-1β的卡那单抗虽能降低炎症水平及心血管疾病发病率，但无法显著改善患者死亡；调脂类mAb虽靶向胆固醇合成介质或低密度脂蛋白，仍在降低心血管事件发生率方面面临挑战[9] 。作为AS发病早期病理生理的重要步骤之一，在这一过程中发挥作用的mAb有一定探索意义，本文以chP3R99为例展开阐述，是一种结合蛋白多糖侧链以影响脂蛋白结合进而干扰脂蛋白蓄积及斑块形成的mAb，具有开发AS候选药物的潜力[10-11] 。尽管已有大量临床前研究表明其有效，但对其结构特性、作用机制、应用障碍和前景并无完整的总结，特此就该点展开说明[12] 。

1 ChP3R99 mAb：含ApoB脂蛋白保留的新兴策略

随着对AS发生和发展的理解不断进步，mAb治疗AS逐渐成为研究重点，不仅靶向低密度脂蛋白和炎症细胞因子，还包括部分关键的血管成分，如旨在减少脂蛋白潴留的新兴抗细胞外基质疗法，主要是针对动脉蛋白聚糖糖链的chP3R99 mAb。chP3R99 mAb作为一种解决动脉壁中含ApoB脂蛋白潴留问题的补充方法[12] 。其通过与动脉蛋白聚糖的硫酸化糖胺聚糖链结合，旨在干扰脂蛋白潴留，从而减轻随后的氧化应激、炎症和其他对斑块形成至关重要的过程。chP3R99 mAb的广泛临床前研究在该病动物模型中显示结果，支持其在预防AS早期阶段或阻止其进展方面的潜力。chP3R99的治疗潜力超出其被动阻断特性，提供双重作用机制：①作为一种被动疗法，通过直接与硫酸化糖胺聚糖结合以急性破坏脂蛋白保留；②作为一种特殊型疫苗，通过在宿主中诱导的抗特异型级联抗体诱导长期保护[1] 。

2 chP3R99单抗的发展及作用机制

chP3R99单抗是由古巴哈瓦那的分子免疫学中心开发而来。其是一种针对动脉细胞外基质内AS早期阶段的小鼠-人嵌合抗体[13] 。chP3R99免疫原为小鼠P3单抗[免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）M类] ，最初目的是为了靶向含NeuGc神经节苷脂的肿瘤组织，后发现chP3R99还有很强的对硫脂质反应性，可与糖基负电荷表位特异结合，且其极性头基团是由硫酸半乳糖组成，而抗原结合部位对应的可变区和高变区碱性氨基酸残基是抗体特异性识别抗原的重要区域[1] 。

改进P3使chP3能保留小鼠可变区域及人IgG1恒定区域，维持亲本抗体的特异性和免疫学特性[14] 。随后，决定chP3重链互补区域1和3（HCDR1、HCDR3）的精氨酸残基的位点特异性单突变完全消除抗原结合，证实这些区域对单抗的特异性至关重要[15] 。进一步研究设计一种对带负电荷的硫酸糖脂具有更高亲和力的突变体。这种chP3突变体，被称为chP3R99，通过在免疫球蛋白HCDR3的第99号位置用精氨酸取代谷氨酸残基设计而成[12] 。为了增加安全性，把Fc区做成LALA突变（L234A/L235A）破坏Fcγ受体、补体结合，避免非特异性炎症激活，目前chP3R99-LALA可通过非结构蛋白小鼠骨髓瘤细胞电穿孔转染实现稳定表达[16] 。

2.1 chP3R99 mAb的被动抗AS机制

chP3R99具有被动抗AS作用的基础：①HCDR区富含精氨酸结构域类似ApoB100B位点通过静电相互作用与动脉蛋白聚糖结合诱导低密度脂蛋白滞留；②关键的脂蛋白潴留分子——硫酸软骨素-糖胺聚糖硫酸化N-乙酰半乳糖胺残基的结构与硫脂质硫酸化半乳糖头基有相似处推断chP3R99能识别硫酸软骨素-糖胺聚糖，且能与含ApoB脂蛋白竞争结合位点，阻止内皮下滞留。

Soto等[12] 研究显示，chP3R99的硫酸化糖胺聚糖亲和力远高于亲本chP3，同时对硫酸软骨素的选择性更高；体内实验中，对Sprague Dawley大鼠静脉注射chP3R99显示，mAb在主动脉壁内的特异性积累，同时这种作用在于接种低密度脂蛋白24 h后大鼠低密度脂蛋白保留和随后氧化的显著降低密切相关；体外实验中，chP3R99识别硫酸软骨素并表现与源自大鼠血管平滑肌细胞的细胞外基质剂量依赖性结合。使用等量浓度的chP3R99和ApoB48进行的固相封闭实验显示，与硫酸软骨素和细胞外基质的残余结合减少70%；对低密度脂蛋白，观察到硫酸软骨素结合的抑制相当，而细胞外基质相互作用的阻断率达到50%[16] 。进一步评估肥胖胰岛素抵抗JCR中的chP3R99，LA-cp大鼠是一种血管重塑模型，可增加硫酸软骨素蛋白聚糖的产生并增强脂蛋白保留，先用chP3R99连续灌注这些大鼠的颈动脉，然后再用荧光标记的乳糜微粒残余物显示剂量依赖性的原位残留抑制；这些颗粒仅取代与颈动脉组织结合的chP3R99（＜35%），而动脉壁中的胆固醇沉积通过处理极大减少（35%~80%），凸显mAb对乳糜微粒残留物的有效性[16] 。一项竞争性灌注实验显示，胰岛素抵抗大鼠低密度脂蛋白滞留、残余脂蛋白滞留率分别是瘦对照大鼠的3.6倍和2.8倍，且chP3R99对低密度脂蛋白滞留的抑制作用更显著，对残余脂蛋白相关胆固醇沉积减少更明显，提示其可同时靶向两类致AS脂蛋白[16] 。

该主动作用机制依靠动脉蛋白聚糖的直接结合，不涉及继发性免疫作用，用于晚期斑块患者的二级预防；采用Fc沉默设计，尽可能降低炎症风险；但对家族性高胆固醇血症及脂蛋白（a）升高群体的一级预防有待进一步研究[17] 。

2.2 chP3R99 mAb的疫苗样作用

作为P3的遗传物质载体，chP3R99不必借助佐剂或载体蛋白可在动物体内激发起对特异型抗体Ab1的强烈免疫效应，且这个免疫事件是基于小鼠V区表位的物种种类固有定序而直接被主要组织相容性复合体Ⅱ类分子在抗原提呈细胞上表达呈现，触发靶向性抗Ab1特异型级联响应[12，18] 。根据Jerne特异型网络假说，chP3R99（即Ab1）能诱导Ab2发生，Ab2β可通过模拟硫酸化糖表位结构引起Ab3的生成，Ab3同样可被Ab1识别，进而双打硫酸软骨素杀伤脂蛋白滞留、促AS/稳定斑块[19-20] 。实验研究显示，chP3R99剂量越大，疫苗样作用越强；不因年龄、性别的不同而存在差异，在4次接种后均达到平台期；ApoE-/-小鼠皮下注射后可诱导Th2相关的抗硫酸软骨素IgG1抗体产生，但无明显促炎反应，也不受年龄、性别的影响；将剂量提高到原来的4倍可增强Ab2和Ab3，但降低人Fc结构域的免疫应答[16] 。

在小鼠、大鼠、兔子模型上均表现稳定的免疫原性[21] 。因此，原始T细胞表位可能在非小鼠系统中失去免疫原性，或可能出现模型特异性表位。然而，该特异型的外来性质确保不同动物模型的持续免疫原性，尽管人类恒定区域可能将免疫优势转移到Fc部分。chP3R99在小鼠、大鼠和兔子中始终表现免疫原性，诱导抗硫酸软骨素抗体能在所有测试模型中阻断脂蛋白保留[1，16] 。此外，将chP3R99的免疫原性转化为人类需要仔细考虑3个因素：①人类白细胞抗原多态性[22] ；②T细胞表位需使抗原提呈细胞呈递抗原——在这种情况下仅限于特异型[23] ；③抗体工程权衡[24] 。事实上，chP3R99的小鼠特异型为T细胞表位提供结构多样性，增加与不同人类白细胞抗原等位基因相容的可能性，以确保抗原呈递[25] 。这是其嵌合化的特点之一，其本质是利用小鼠可变区保留T细胞表位，人IgG1-LALA Fc区以延长半衰期且避免Fc介导的炎症反应[1，12] 。

2.3 chP3R99 mAb抗AS作用的临床前证据

在早期和晚期AS模型中均有较明显的缓解疗效，新西兰兔急性AS模型中使用20%脂质乳剂Lipofundin诱导AS后以chP3R99预防性免疫（每周100 μg皮下注射3次）可使57%的动物完全预防AS病变，剩余动物仅有轻度内膜增厚且可减少脂质过氧化、保持内皮一氧化氮供体一氧化氮生物利用度[12] 。在高脂高胆固醇饮食饲养的ApoE-/-小鼠慢性AS模型中从6周龄开始每2周给予chP3R99（50 μg/只，皮下注射），共给药6次，18周龄AS病变组织损伤面积较对照组明显减轻40%~43%，该保护作用可能来源于宿主源性抗硫酸软骨素抗体（Ab3）[26] 。在这两种模型中，这种保护与宿主源性抗硫酸软骨素抗体（Ab3）有关，该抗体在体外阻断低密度脂蛋白-硫酸软骨素结合，可支持诱导保护性独特型级联的假设[1，27] 。

研究显示，脂质芬丁诱导形成病变的兔子经过chP3R99每周1次皮下注射（100 μg，共5周）后主动脉氧化应激水平降低、抗氧化能力及一氧化氮生物利用度增加；高脂饮食喂养的ApoE-/-小鼠chP3R99免疫，可使AS病变减轻35%~40%且无性别差异，当其剂量增加到每周200 μg/只时，导致AS病变减少62%[28] 。由此可知，chP3R99除有被动作用外，还有激活免疫产生的特异性抗原，即抗体发挥作用，这两种效应可能具有协同增效的作用。对病程为11周ApoE-/-小鼠建立的主AS动物模型，给予chP3R99处理，能抑制主动脉病变面积扩大及抑制主动脉炎症细胞浸润[16] 。

从诊断潜力看，在使用放射性标记的99mTcchP3R99对Lipofundin诱导的早期AS兔模型研究中，可在AS易发区域的颈动脉病变处被特异性地富集，且在患病动物AS易发区的含量是对照组的6倍；生物分布研究显示，99mTc-chP3R99对动脉平滑肌细胞源性PG具有较高的选择性，非血管组织的聚集较少，同时在小鼠、大鼠、兔模型中均无脂质代谢紊乱及肝肾功能损伤等毒性反应出现[29] 。

3 讨论与小结

即使有越来越多的调脂、抗感染治疗方法，AS仍有残留的心血管危险性，而现有药物均不能很好地控制脂蛋白（a）和饮食中含有的某些残余脂蛋白，也无在动脉细胞外基质中靶点脂蛋白或蛋白聚糖诱导氧化应激或炎症，而是相对单一地着眼于系统性危险因素。chP3R99是通过被动阻断动脉脂蛋白蓄积并具有疫苗样的作用阻断AS的发生和发展，可有效预防AS的发生和发展，且能延缓和逆转晚期病变的发展，在AS全程发挥重要作用。目前chP3R99的人类转化验证及对脂蛋白（a）的疗效需进一步探索，不过这一以细胞外基质为靶点的治疗方法弥补了现有的不足之处，能降低残余风险，完善AS的治疗方式。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

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【作者机构】	¹内蒙古医科大学附属医院神经外科； ²浙江省宁波市第二医院神经外科
【分类号】	R743
【基金】	内蒙古自治区自然科学基金资助项目(2024MS08053)

chP3R99单克隆抗体在动脉粥样硬化中的研究进展

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