急性高原缺氧性心肌损伤（acute altitude hypoxic myocardial injury，AAHMI）是高原常见病症之一，发病率较高，严重时可危及生命[1-2]。目前，相关治疗方案的效果不尽如人意，且药物治疗本身也存在明显的局限性与不良反应。AAHMI的发生与线粒体结构和功能密切相关[3-4]。线粒体通过融合和分裂即线粒体动力学维持其结构与功能稳定，且与心肌损伤密切相关[5]。线粒体的融合主要是由OPA1和MFN1/2介导[6]；调控线粒体分裂的蛋白主要有FIS1和DRP1[7]。急性缺氧时，AMPK通过磷酸化被激活，p-AMPK可激活PGC-1α来调节线粒体动力学，维持线粒体的结构与功能[8]。有研究显示，井穴刺络放血可有效减轻心肌损伤，但其作用机制尚不明确[9]。因此，本研究旨在从AMPK/PGC-1α通路调节线粒体动力学角度，深入探讨井穴刺络放血对AAHMI的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级8~10周龄雄性C57BL/6小鼠120只（体质量20~25 g），购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物合格证号：110011241103735146，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2021-0006。实验动物于青海大学医学院中医药省级重点实验室进行标准化饲养，实验单位使用许可证号：SYXK（青）2021-0002，饲养温度（23±2）℃、湿度（50±5）%。本研究经青海大学科技伦理委员会批准（PJ202401-24）。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂 小鼠肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）、心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（货号：E-EL-M0355、E-EL-M1203，上海茁彩生物科技有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：P0009，上海碧云天生物技术有限公司）；β-actin抗体（货号：AC026，武汉爱博泰克生物科技有限公司）；AMPK抗体（货号：ET1608-40，杭州华安生物技术有限公司）；DRP1抗体、OPA1抗体、PGC-1α抗体（货号：ab184247、ab157457、ab54481，上海艾博抗贸易有限公司）；FIS1抗体、MFN2抗体（货号：10956-1-AP、12186-1-AP，武汉三鹰生物技术有限公司）；p-AMPK抗体（货号：2535，上海赛信通生物试剂有限公司）；伊红染液（货号：YE2080，合肥博美生物科技有限责任公司）；苏木精染液[货号：H9627，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司]。

1.2.2 主要仪器 酶标仪（型号：SpectraMAX Plus384，上海美谷分子仪器有限公司）；生物显微镜（型号：BA210Digital，厦门麦克奥迪实业集团有限公司）；透射电子显微镜（型号：JEM-1400FLASH，日本电子株式会社）；实时荧光定量PCR仪（型号：QuantStudio TM3，美国Thermo Fisher Scientific公司）；低压氧舱（型号：DXY-3000，贵州风雷航空军械有限责任公司）。

1.3 动物分组及AAHMI模型构建

120只C57BL/6小鼠适应性饲养1 d后，按照随机数字表法分为正常对照组、低氧模型组、非穴位放血组、井穴刺络放血组、AMPK激动剂组、井穴刺络放血+ AMPK抑制剂组，每组20只。

参考本课题组前期造模方法，正常对照组小鼠全程置于海拔2 260 m环境下正常饲养，自由饮水、进食；其余各组小鼠在舱外治疗4 d后，第5天放入低压低氧动物实验舱，舱内模拟海拔6 000 m高原低氧环境，持续缺氧暴露72 h（自放入舱内并达到设定海拔条件后开始计时），以建立AAHMI小鼠模型[9]。其间除低氧模型组外，非穴位放血组、井穴刺络放血组、AMPK激动剂组、井穴刺络放血+AMPK抑制剂组小鼠每日在固定时间接受1次相应治疗。所有小鼠均自由饮水、进食，全程密切观察并记录其生存状况。以心肌细胞变性，线粒体肿胀、嵴断裂或减少等表现为造模成功。

在造模期间治疗时，实验人员先进入缓冲舱并关闭舱门。待缓冲舱升至4 000 m、实验舱降至相同高度后，打开中间舱门实施治疗。操作完成后，实验人员返回缓冲舱并关闭中间舱门，随后实验舱再升至6 000 m。

1.4 治疗方法

正常对照组、低氧模型组每天抓取10 s，无其他处理。非穴位放血组每天剪尾尖放血，用微量毛细血管收集血液，放血量约为15 μl。井穴刺络放血组依据人体井穴的解剖标志，结合比较解剖学，并参考实验动物针灸图谱相关穴位的具体位置进行准确定位[10]；使用一次性末梢采血针点刺前后肢井穴。前肢井穴包括少商、商阳、中冲、关冲、少冲；后肢井穴包括隐白、大敦、厉兑、足窍阴、至阴。操作顺序为左前肢、右前肢、左后肢、右后肢。用微量毛细血管收集血液，每次放血量约为15 μl。AMPK激动剂组：将40 mg的AICAR溶解于2 ml灭菌生理盐水中，配置浓度为20 mg/ml工作液，每只小鼠腹腔注射0.1 ml工作液。井穴刺络放血+AMPK抑制剂组：将10 mg的Compound C溶解于0.2 ml的DMSO中，充分振荡溶解，再加入9.8 ml灭菌生理盐水，配置浓度为1 mg/ml工作液。井穴刺络放血治疗后，每只小鼠腹腔注射0.5 ml工作液。各组治疗于实验开始起每日干预1次，连续干预7 d。

1.5 标本采集

实验结束后，将小鼠从低压低氧动物实验舱内取出，用腹腔注射麻醉，采血后静置1 h，4 ℃下4 000 r/min离心15 min（离心半径6.4 cm），取血清保存。取心脏，用低温生理盐水清洗3次，清除残血，滤纸吸干；6只小鼠心脏组织固定于10%多聚甲醛溶液中，3只小鼠心脏组织固定于电镜固定液中，剩余小鼠心脏组织存于-80 ℃冰箱，用于相关指标检测。

1.6 观察指标及检测方法

1.6.1 HE染色法观察心肌形态学变化 从10%多聚甲醛溶液中取出心脏组织，依次脱水、包埋、切片（厚度约4 μm）、脱蜡、复水、染色；染色完成后使用中性树胶封片，先于低倍下观察全部组织，采集400倍显微图像，观察其心肌病理变化。

1.6.2 透射电镜观察心肌细胞及线粒体损伤情况 取出电镜固定液中的心脏组织，缓冲液冲洗后使用1%锇酸溶液固定，丙酮逐级脱水[30%→50%→70%→80%→90%→95%→100%（100%浓度换3次）]，渗透（比例分别为3∶1、1∶1、1∶3），包埋后切片厚度为60~90 nm，经醋酸铀10~15 min、柠檬酸铅1~2 min染色后于透射电镜下观察。

1.6.3 ELISA法检测血清心肌损伤标志物表达 取冻存血清复温后，严格按照试剂盒使用说明书步骤经包被抗原/抗体、洗板、封闭、加样、加检测抗体、加二抗、洗板、显色、终止步骤后经酶标仪测定CK-MB、cTnI光密度值，按说明书计算浓度。

1.6.4 Western blot法检测心脏组织MFN2、OPA1、DRP1、FIS1、AMPK、p-AMPK，PGC-1α蛋白表达 取出冻存小鼠心脏组织，在冰上剪成碎块。使用PBS溶液洗涤组织，吸出PBS溶液，加入裂解缓冲液，裂解物在冰上放置30 min，其间每10 min颠倒1次。4 ℃下12 000 r/min离心10 min（离心半径9.8 cm），取上清液并将其转入新的EP管中备用。BCA法蛋白质定量后于95 ℃恒温下加热变性，按照上样、电泳、转膜、封闭、孵育抗体[一抗4 ℃孵育过夜：MFN2（1∶5 000）、OPA1（1∶1 000）、DRP1（1∶1 000）、FIS1（1∶2 000）、AMPK（1∶5 000）、p-AMPK（1∶1 000）、PGC-1α（1∶1 000）、β-actin（1∶50 000），次日回收一抗；TBST洗PVDF膜3次，每次10 min；将PVDF膜放入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（1∶8 000）中，于摇床上轻摇，室温孵育2 h]、显影、定影步骤依次操作、最后对条带进行曝光，扫描曝光结果，并以目的蛋白积分光密度表示。

1.6.5 RT-qPCR法检测AMPK、PGC-1α mRNA表达 取心脏组织于EP管中，加入TRIzol裂解液，使用高速低温组织研磨仪匀浆，经氯仿萃取、异丙醇沉淀、乙醇洗涤后提取总RNA。提取的RNA经反转录试剂盒去除基因组DNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板，采用TB Green法进行RT-qPCR检测，反应体系：TB Green Premix Ex Taq™ Ⅱ（Tli RNaseH Plus）10.0 μl，正向引物（10 μmol/L）0.8 μl，反向引物（10 μmol/L）0.8 μl，Template cDNA 2.0 μl，ddH2O 6.4 μl，总体积20.0 μl。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸并采集荧光30 s，共45个循环。以β-actin作为内参基因，采用2-△△Ct法计算目标基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

基因名称引物序列（5’→3’）（bp）AMPK正向引物：GAGTGTTCGGAGGAGGAGGTC 21反向引物：CTGTTGTCTATGATGAGGTGGTAGG 25反向引物：CGTCTGAGTTGGTATCTAGGTC 22β-actin正向引物：CTACCTCATGAAGATCCTGACC 22引物大小PGC-1α正向引物：GGATATACTTTACGCAGGTCGA 22反向引物：CACAGCTTCTCTTTGATGTCAC 22

1.7 统计学方法

采用SPSS 28.0统计学软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，满足方差齐性两两比较采用LSD-t检验，不满足方差齐性则采用Tamhane’s T2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心肌形态学变化

正常对照组心肌组织结构正常，心肌纤维排列整齐，无明显变性或坏死。低氧模型组及非穴位放血组心肌细胞出现变性，部分胞质内可见细小空泡、染色不均及嗜酸性增强。与非穴位放血组比较，井穴刺络放血组心肌损伤程度减轻。与井穴刺络放血组比较，AMPK激动剂组病变程度差异不明显；井穴刺络放血+AMPK抑制剂组心肌损伤程度升高。见图1。

图1 各组心肌形态学变化（×400）

2.2 各组心肌及线粒体损伤情况

正常对照组心肌细胞形态结构较正常，线粒体呈椭圆形，嵴清晰平直。低氧模型组及非穴位放血组心肌细胞形态结构明显异常，心肌细胞的细胞核呈梭形，染色质丢失，大量线粒体已发生肿胀，嵴减少或断裂，部分线粒体外膜破裂。井穴刺络放血组心肌细胞形态结构轻微异常，细胞核呈不规则形，染色质分布均匀，线粒体呈椭圆形，嵴较为清晰平直。AMPK激动剂组心肌细胞及线粒体的形态结构轻微异常，线粒体呈椭圆形，嵴较为清晰平直。井穴刺络放血+AMPK抑制剂组心肌细胞形态结构中度异常，细胞核呈不规则形，染色质分布均匀，线粒体轻度肿胀，嵴部分减少或断裂。见图2。

图2 各组心肌细胞及线粒体结构变化（×20 000）

2.3 各组血清CK-MB、cTnI表达比较

与正常对照组比较，低氧模型组血清CK-MB、cTnI表达升高（P＜0.01）；非穴位放血组与低氧模型组血清CK-MB、cTnI表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与非穴位放血组比较，井穴刺络放血组血清CK-MB、cTnI表达降低（P＜0.01或P＜0.05）；与井穴刺络放血组比较，井穴刺络放血+AMPK抑制剂组血清CK-MB、cTnI表达升高（P＜0.01）。见图3。

图3 各组CK-MB、cTnI表达比较（n=8）

2.4 各组心脏组织MFN2、OPAl、DRP1、FIS1蛋白表 达比较

与正常对照组比较，低氧模型组心脏组织MFN2、OPA1蛋白表达降低，DRP1、FIS1蛋白表达升高（P＜0.01）。非穴位放血组与低氧模型组心脏组织OPA1、DRP1、FIS1蛋白表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与低氧模型组比较，非穴位放血组MFN2蛋白表达升高（P＜0.01）。与非穴位放血组比较，井穴刺络放血组心脏组织MFN2、OPA1蛋白表达升高，DRP1、FIS1蛋白表达降低（P＜0.01）。与井穴刺络放血组比较，井穴刺络放血+AMPK抑制剂组心脏组织MFN2、OPA1蛋白表达降低，DRP1、FIS1蛋白表达升高（P＜0.01）。见图4、图5。

图4 线粒体动力学相关蛋白条带

图5 各组心脏组织MFN2、OPA1、DRP1、FIS1蛋白表达比较（n=3）

2.5 各组心脏组织AMPK、p-AMPK、PGC-1α蛋白表达比较

各组心脏组织AMPK蛋白表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与正常对照组比较，低氧模型组心脏组织p-AMPK、PGC-1α蛋白表达升高（P＜0.05）。非穴位放血组与低氧模型组心脏组织p-AMPK、PGC-1α蛋白表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与非穴位放血组比较，井穴刺络放血组心脏组织p-AMPK、PGC-1α蛋白表达升高（P＜0.01）。与井穴刺络放血组比较，AMPK激动剂组心脏组织PGC-1α蛋白表达升高（P＜0.01）；井穴刺络放血+AMPK抑制剂组心脏组织p-AMPK、PGC-1α蛋白表达降低（P＜0.05或P＜0.01）。见图6、图7。

图6 AMPK/PGC-1α通路蛋白条带

图7 各组心脏组织AMPK、p-AMPK、PGC-1α蛋白表达比较（n=3）

2.6 各组心脏组织AMPK、PGC-1α mRNA表达比较

与正常对照组比较，低氧模型组心脏组织AMPK、PGC-1α mRNA表达升高（P＜0.05）。非穴位放血组与低氧模型组心脏组织AMPKA、PGC-1αmRNA表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与非穴位放血组比较，井穴刺络放血组心脏组织AMPK、PGC-1α mRNA表达升高（P＜0.01）。与井穴刺络放血组比较，井穴刺络放血+AMPK抑制剂组心脏组织AMPK、PGC-1α mRNA表达降低（P＜0.05或P＜0.01）。见图8。

图8 各组心脏组织AMPK、PGC-1α mRNA表达比较（n=3）

3 讨论

AAHMI为高原常见疾病之一，临床可表现为心慌、呼吸急促、胸部憋闷不适等症状[11]。心肌是机体代谢最旺盛的器官之一，心肌代谢对缺血缺氧十分敏感，当人们进入高原时，会出现血管扩张、血氧饱和度下降、呼吸频率和心率加快，这些变化会加剧心肌损伤，并且随着海拔的升高，上述症状进一步加重[12-13]。超过3 000 m海拔时，急性高原暴露会造成严重的充血性心力衰竭，造成严重的心肌损伤[14]。心肌损伤进一步加重可造成心源性猝死[15]。目前西医治疗虽可缓解症状，但存在胃肠道反应、过敏、低血压等不良反应且疗效有限[16]。因此，本研究选取井穴刺络放血中医特色治疗方案。

《素问·缪刺论篇》中最早有关井穴刺络放血相关记载：“邪客于五脏之间，其病也，脉引而痛，时来时止，视其病缪刺于手足爪甲上，视其脉，出其血，间日一刺，一刺不已，五刺已。”《素问》首次提出井穴刺络放血有救急救重之疗效，此外手少阴心经井穴少冲可直接治疗心脏相关疾病[17]。心包代心受邪，故手厥阴心包经井穴中冲亦可治疗心脏疾病。且现有研究发现，通过井穴刺络放血预处理，能改善心肌细胞坏死、细胞凋亡，下调CK-MB、cTnI表达，对急性高原低氧心肌损伤有保护作用[18]。本研究结果显示，与低氧模型组比较，井穴刺络放血组心肌损伤程度减轻，且血清中心肌损伤标志物CK-MB、cTnI表达降低，提示井穴刺络放血能改善AAHMI。

心脏作为供血器官，需要线粒体提供大量能量，因此线粒体稳态对于维持心脏正常结构和功能尤为重要[19]。线粒体动力学是维持线粒体稳态的重要机制，线粒体分裂通过分离损伤和未损伤的线粒体，达到清除受损线粒体的作用，而线粒体融合能使损伤的线粒体修复实现功能互补[20]。在缺氧时，线粒体过度分裂，导致线粒体碎片化，失去正常结构，融合减弱，稳态受到破坏[21]。本研究结果显示，低氧模型组大量线粒体已发生肿胀，即体积变大，嵴减少或断裂，基质溶解呈絮状，电子密度降低，部分线粒体外膜破裂；而井穴刺络放血组线粒体损伤程度明显减轻，且线粒体融合相关蛋白MFN2、OPA1蛋白表达升高，分裂相关蛋白DRP1、FIS1蛋白表达降低。本研究提示井穴刺络放血可能通过调控线粒体动力学来达到治疗AAHMI的目的。

AMPK参与线粒体动力学的调节，可以通过上调其下游分子PGC-1α的转录，刺激线粒体分裂融合过程[22]。在缺氧时，ATP生成减少，AMP水平升高，导致AMPK通过磷酸化被激活，p-AMPK激活PGC-1α，PGC-1α能够进一步激活下游NRF-1和TFAM，进行线粒体修复，增加ATP产量，使能量代谢恢复平衡[23-24]。此外，AMPK/PGC-1α通路可以上调线粒体融合相关蛋白及下调线粒体分裂相关蛋白来调节线粒体动力学，达到维持线粒体稳态的目的[25]。本研究结果显示，低氧模型组心脏组织p-AMPK、PGC-1α蛋白及AMPK、PGC-1α mRNA表达升高，且井穴刺络放血组相关表达进一步升高；而与井穴刺络放血组比较，井穴刺络放血+AMPK抑制剂组表达降低。本研究提示井穴刺络放血可能激活AMPK/PGC-1α通路以调控线粒体动力学。

综上所述，井穴刺络放血可能通过激活AMPK/PGC-1α通路来调控线粒体动力学，达到治疗AAHMI的作用。本研究为井穴刺络放血治疗AAHMI提供了实验依据；但是本研究只着重对线粒体动力学进行研究，未来可继续研究井穴刺络放血对整个线粒体质量控制的影响。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

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Study on the mechanism of bloodletting acupuncture at jing-well points for acute altitude plateau hypoxic myocardial injury based on the regulation of mitochondrial dynamics by AMPK/PGC-1α pathway

OUYANG Shuai1 GUO Xuejing1 ZHU Zhifang1 TONG Li2 LI Yongping1

1.Department of Traditional Chinese Medicine, Qinghai University Medical College, Qinghai Province, Xining 810001,China; 2.Qinghai Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Research for Glucolipid Metabolic Diseases, Qinghai Province, Xining 810001, China

[Abstract] Objective To investigate the effects and mecha altitude hypoxic myocardial injury (AAHMI) in mice, by examining the regulation of mitochondrial dynamics via the AMPK/PGC-1α pathway. Methods A total of 120 SPF-grade male C57BL/6 mice, aged 8-10 weeks were selected,and they were divided into normal control group, hypoxia model group, non-acupoint bloodletting group, bloodletting acupuncture at jing-well points group, AMPK agonist group, and bloodletting acupuncture at jing-well points+AMPK inhibitor group by random number table method, with 20 mice in each group. Except for the normal control group, all other groups of mice used the hypobaric and hypoxic animal experiment chamber to construct the AAHMI mouse model. The normal control group and the hypoxia model group were captured for ten seconds every day without any other treatment; in the non-acupoint bloodletting group, the tail tip was cut for bloodletting every day, with a bloodletting volume of approximately 15 μl; in the bloodletting acupuncture at jingwell points group, disposable peripheral blood collection needles were used to puncture the well points of the anterior and posterior limbs, with a bloodletting volume of approximately 15 μl; the AMPK agonist group was intraperitoneally injected with 0.1 ml of AICAR working solution (concentration 20 mg/ml); and the bloodletting acupuncture at jing-well points+AMPK inhibitor group was intraperitoneally injected with 0.5 ml of Compound C working solution (concentration 1 mg/ml) after well acupoint bloodletting. Each group was treated once a day starting from the beginning of the experiment for seven consecutive days. Myocardial and mitochondrial structures were examined via HE staining and transmission electron microscopy; the levels of serum creatine kinase-MB (CK-MB) and cardiac troponin I (cTnI) were measured using enzyme-linked immunosorbent assay;the expression of MFN2, OPA1, DRP1, FIS1, AMPK, p-AMPK, and PGC-1α protein in cardiac tissues were detected by Western blot; and the expression of AMPK and PGC-1α mRNA in cardiac tissues were determined by RT-qPCR. Results The myocardial tissue structure of the normal control group was normal, the morphology and structure of myocardial cells were relatively normal, and the mitochondria were oval-shaped. In the hypoxia model group and the non-acupoint bloodletting group, myocardial cells showed degeneration, with significantly abnormal morphology and structure of myocardial cells, and a large number of mitochondria had swollen. Compared with the non-acupoint bloodletting group, the degree of myocardial injury in the bloodletting acupuncture at Jingwell points group was reduced, the morphology and structure of myocardial cells were slightly abnormal, and the mitochondria were oval-shaped. Compared with the bloodletting acupuncture at Jing-well points group, there was no significant difference in the degree of lesion in the AMPK agonist group; and the degree of myocardial injury increased in the bloodletting acupuncture at Jing-well points+AMPK inhibitor group, with moderate abnormalities in the morphology and structure of myocardial cells and mild swelling of mitochondria. Compared with the normal control group, the expressions of serum CK-MB and cTnI, as well as p-AMPK, PGC-1α, DRP1, and FIS1 protein, and AMPK, PGC-1α mRNA in cardiac tissues in the hypoxia model group increased; while the expressions of MFN2 and OPA1 protein in cardiac tissues decreased (P＜0.05 or P＜0.01). Compared with the non-acupoint bloodletting group, the expressions of serum CK-MB and cTnI, as well as DRP1 and FIS1 protein in cardiac tissues in the bloodletting acupuncture at Jing-well points group decreased; while the expressions of MFN2, OPA1, p-AMPK, PGC-1α protein and AMPK, PGC-1α mRNA in cardiac tissues increased (P＜0.05 or P＜0.01). Compared with the bloodletting acupuncture at Jing-well points group, the expressions of serum CK-MB and cTnI, as well as DRP1 and FIS1 protein in cardiac tissues in the bloodletting acupuncture at Jing-well points+AMPK inhibitor group increased; while the expressions of MFN2, OPA1, p-AMPK, PGC-1αprotein and AMPK, PGC-1α mRNA in cardiac tissues decreased (P＜0.05 or P＜0.01). Conclusion Bloodletting acupuncture at jing-well points can alleviate AAHMI in mice, and the mechanism may be related to the activation of the AMPK/PGC-1α pathway to regulate mitochondrial dynamics.

[Key words] Bloodletting acupuncture at jing-well points; Mitochondrial dynamics; Acute altitude hypoxic myocardial injury; AMPK/PGC-1α pathway

[中图分类号] R245.99

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）08（b）-0043-09

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25110656

[作者简介] 欧阳帅（2000-），男，青海大学医学院中医系2023级针灸推拿学专业在读硕士研究生；研究方向：针灸干预治疗高原相关疾病。

[通信作者] 李永平（1978-），男，硕士，教授，硕士生导师，主要从事针灸效应机制研究工作。

[基金项目] 青海省科技厅应用基础研究项目（2020-ZJ-760）；青海省“昆仑英才·高层次教育教学人才”项目。

（收稿日期：2025-11-09）

（修回日期：2026-03-17）