温胆汤最早记载于孙思邈所著《备急千金要方》，现广泛应用于心血管系统、神经系统、消化系统等系统疾病[1]。广州中医药大学第一附属医院制剂温胆片具有镇静、安神和抗惊厥的作用，用于治疗广泛性焦虑症[2]。课题组基于前期研究及临床实践，在温胆片基础上开展温胆汤加减方治疗冠心病伴抑郁、焦虑的研究[3]。加味温胆方主要由枳实、柴胡、茯神、化橘红等组成，具有解郁疏肝、清心安神、健脾化痰的功效。枳实为加味温胆方的主药之一，《中华人民共和国药典》[4]2020年版收载了枳实的两种基原酸橙和甜橙，两种基原的枳实在黄酮类成分上存在明确差异[5]。鉴于不同基原枳实对加味温胆方汤剂质量差异的影响，课题组对酸橙枳实、郁金、竹茹等组方的加味温胆汤与甜橙枳实、醋郁金、姜竹茹等组方的解郁温胆汤分别进行了指纹图谱及质量标志物含量测定研究，并分别研制成加味温胆片及解郁温胆颗粒。

中药制剂成分复杂，常含有抑菌性成分或本身理化性质可能干扰微生物的生长与检出[6]。若不经相关方法验证，直接采用常规检查法，可能导致假阴性结果，无法真实反映产品的微生物污染状况，或出现假阳性结果，造成浪费与误判[7]。本研究旨在依据《中华人民共和国药典》[4]2020版相关规定，系统开展解郁温胆颗粒与加味温胆片的微生物限度检查方法适用性试验，从而建立了两种制剂的微生物限度检查方法。

1 实验器材

1.1 仪器

电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，PL601-L，实际分度值=0.1 g）；手提式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂，DSX-24KBY）；电热鼓风干燥箱（上海三腾仪器有限公司，BON-250）；生物洁净安全柜（苏州净化设备有限公司，BHC-1300）；生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司，LRH-250）；生化培养箱（上海三腾仪器有限公司，BZR-150B）；pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司，PHS-3E）。

1.2 试药

解郁温胆颗粒（广州中医药大学第一附属医院制剂中心，批号：20240301、20240302、20240303，规格：10 g/包）；加味温胆片（广州中医药大学第一附属医院制剂中心，批号：20240701、20240702、20240703，规格：100片/瓶）。磷酸二氢钾（广东广试试剂科技有限公司，批号：2023120126）、磷酸氢二钠（广东广试试剂科技有限公司，批号：2023120231）和氯化钠（海润捷科技发展有限公司，批号：20231026）用于自制pH 7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。

1.3 培养基

胰酪大豆胨液体培养基（北京陆桥技术股份有限公司，批号：230617）；胰酪大豆胨琼脂培养基（北京陆桥技术股份有限公司，批号：220426）；沙氏葡萄糖琼脂培养基（北京陆桥技术股份有限公司，批号：230506）；麦康凯液体培养基（北京陆桥技术股份有限公司，批号：230323）；麦康凯琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司，批号：1111231）；细菌学蛋白胨（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3211037）。

1.4 菌种

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、白念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉菌[CMCC（F）98003]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]，以上菌种均购自浙江泰林生物技术股份有限公司，以上工作菌株均5代以内。

2 方法和结果

2.1 供试品的制备

分别取解郁温胆颗粒和加味温胆片各10 g，研碎后分别加入100 ml的pH 7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，充分溶散后，静置10 min，分别取上层液体作为解郁温胆颗粒和加味温胆片1∶10的供试品，再分别取1∶10的供试品用缓冲液稀释成1∶20的供试品。

2.2 菌液的制备

按照2020年版《中华人民共和国药典》[8]四部通则1105要求，取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白念珠菌，分别加入1.1 ml溶解剂进行复溶，制成每1 ml含菌数不大于104 cfu的菌悬液。

取黑曲霉菌的新鲜培养物加入适量含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的pH 7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液将孢子洗脱，然后用无菌纱布滤去菌丝吸出孢子悬液至装有玻璃珠的灭菌容器中，并用0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的pH 7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1 ml含孢子不大于104 cfu的孢子悬液[9]。

2.3 计数方法适用性试验

2.3.1 试验组 ①需氧菌：取“2.1”项下1∶10、1∶20的供试品各9.9 ml，分别加入“2.2”项下的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白念珠菌的试验菌悬液各0.1 ml，以及黑曲霉孢子悬液0.1 ml，混匀，吸取2 ml分注2个平皿中，立即倾注15~20 ml温度不超过45 ℃融化的胰酪大豆胨琼脂培养基，摇匀，凝固后置于32.5 ℃培养，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌培养不超过3 d；白念珠菌、黑曲霉菌培养不超过5 d[10]。②霉菌和酵母菌：取“2.1”项下1∶10、1∶20的供试品各9.9 ml，分别加入黑曲霉孢子悬液0.1 ml，混匀，吸取2 ml分注2个平皿中，立即倾注15~20 ml温度不超过45 ℃融化的沙氏葡萄糖琼脂培养基，摇匀，凝固后置于22.5 ℃培养不超过7 d。

2.3.2 供试品对照组 取“2.1”项下1∶10、1∶20的供试品，以稀释液（pH 7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）代替菌液同试验组操作。

2.3.3 菌液对照组 取稀释液代替供试品，按试验组操作，加入试验菌悬液进行回收试验。

2.3.4 阴性对照试验 以稀释液代替供试品，进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。

2.3.5 计算公式 回收比值＝（试验组平均菌落数-供试对照组平均菌落数）/菌液对照组平均菌落数。

2.3.6 结果判断 依据《中华人民共和国药典》[8]2020年版四部，回收比值应在0.5~2.0。以上实验，需氧菌培养于第3天观察菌落生长情况；霉菌和酵母菌于培养第7天观察菌落生长情况；需氧菌中白念珠菌和黑曲霉菌于培养第5天观察菌落生长情况，结果见表1、表2。结果显示，需氧菌总数方面，1∶10和1∶20的解郁温胆颗粒供试品的回收比值均符合要求，1∶10的加味温胆片供试品中铜绿假单胞菌回收比值和枯草芽孢杆菌的部分回收比值小于0.5，1∶20的加味温胆片供试品的回收比值符合要求；霉菌和需氧菌总数方面，1∶10和1∶20的解郁温胆颗粒和加味温胆片供试品的回收比值均符合要求。因此，解郁温胆颗粒和加味温胆片分别采用1∶10和1∶20浓度供试品按平皿法进行需氧菌总数检查，两个制剂均可采用1∶10浓度供试品按平皿法进行霉菌和酵母菌总数检查。

表1 需氧菌总数计数方法回收率

1∶101∶20菌株批号试验组菌液组供试品对照组阴性对照组试验组菌液组供试品对照组阴性对照组回收比值回收比值（个）（个）（个）（个）（个）（个）（个）（个）解郁温胆颗粒金黄色葡萄球菌202403014850000.964657000.81202403025350001.064948001.02202403034448000.925657000.98铜绿假单胞菌202403013633001.093835001.09202403024046000.873835001.09202403033333001.004139001.05枯草芽孢杆菌202403015259000.885450001.08202403023941000.955155000.93202403033940000.984953000.92白念珠菌202403013538000.924039001.03202403023638000.953539000.90202403033537000.954136001.14黑曲霉菌202403014145000.913843000.88202403024045000.893842000.90202403033337000.893537000.95加味温胆片金黄色葡萄球菌202407014259000.714958000.84202407023857000.673951000.76202407034149000.843545000.78铜绿假单胞菌202407011357000.233249000.65202407021446000.303042000.71202407031447000.303038000.79枯草芽孢杆菌202407012650000.523949000.80202407022452000.463446000.74202407032144000.483448000.71白念珠菌202407014449000.903748000.77202407023538000.923943000.91202407034047000.854049000.82黑曲霉菌202407014638001.213938001.02202407023738000.973538000.92202407033742000.884242001.00

表2 霉菌和酵母菌总数计数方法回收率

1∶101∶20菌株批号试验组菌液组供试品对照组阴性对照组试验组菌液组供试品对照组阴性对照组回收比值回收比值（个）（个）（个）（个）（个）（个）（个）（个）解郁温胆颗粒白念珠菌202403013440000.853741000.90202403023538000.923539000.90202403033538000.923937001.05黑曲霉菌202403013136000.863639000.92202403023237000.863641000.88202403033832001.193332001.03加味温胆片白念珠菌202407013040000.753145000.69202407023650000.723542000.83202407033436000.944252000.81黑曲霉菌202407014447000.943446000.74202407023741000.903441000.83202407033238000.843439000.87

2.4 控制菌检查方法适用性试验

供试品的制备方法同“2.1项”下方法，试验菌悬液的制备同“2.2项”下金黄色葡萄球菌的制备方法，制成每1 ml含菌数不大于102的大肠埃希菌悬液。

2.4.1 试验组 取“2.1”项下1∶10的供试品10 ml分别加入100、200 ml胰酪大豆胨液体培养基中，并分别加入不大于100 cfu大肠埃希菌，混匀，32.5 ℃培养24 h。分别取上述培养物1 ml，接种至含100 ml麦康凯液体培养基中，43 ℃培养24 h。分别取麦康凯液体培养基培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，32.5 ℃培养24 h。

2.4.2 供试品对照组 取稀释液（pH 7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）代替菌液，同试验组操作。

2.4.3 阳性对照组 取稀释液代替供试品，加入试验菌悬液，按试验组操作。

2.4.4 阴性对照试验 以稀释液代替供试品，进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。

2.4.5 结果判断 依据《中华人民共和国药典》[8]2020年版四部通则1106和1107，若麦康凯琼脂培养基上无菌落生成，或虽有菌落生成但菌落不同于大肠埃希菌菌落形态特征及鉴定结果为阴性，判定为供试品未检出大肠埃希菌。若麦康凯琼脂平板上有菌生长，观察菌落形态特征，必要时进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌。

控制菌试验结果见表3，结果显示供试品对照组和阴性对照组均无菌生长，阳性对照组和试验组在100 ml胰酪大豆胨液体培养基中试验菌均生长良好，能检出相应控制菌，因此可以使用常规法进行控制菌检查。

表3 控制菌检查法验证结果

培养基批号试验组阳性对照组供试品对照组阴性对照组解郁温胆颗粒胰酪大豆胨液体培养基20240301浑浊浑浊澄清澄清麦康凯液体培养基20240302黄色黄色紫色紫色麦康凯琼脂培养基20240303++--加味温胆片胰酪大豆胨液体培养基20240701浑浊浑浊澄清澄清麦康凯液体培养基20240702黄色黄色紫色紫色麦康凯琼脂培养基20240703++--

注 “+”表示培养基浑浊、变色、产气或有符合试验菌外形特征的菌落生长；“-”表示培养基澄清无菌生长。

3 讨论

微生物限度检查是用于检测和控制药品中微生物数量和种类的方法，《中华人民共和国药典》[8]2020年版四部规定了非无菌药品的微生物限度检查法，要求明确所采用的检查方法能够准确、可靠地检出药品中可能存在的微生物。

解郁温胆颗粒和加味温胆片这两种制剂的中药组方相同，但含两种不同基原的枳实，其有效成分含量上存在明显差异，其中黄酮类、酚酸类等化合物具有抑菌作用，叠加经醇沉工艺处理制备的片剂载药量明显大于颗粒剂，方中药味所含有效成分的差异更大，因此加味温胆片的抑菌作用较解郁温胆颗粒更显著[11-12]。采用常规法试验结果显示加味温胆片对铜绿假单胞菌的抑制作用比较明显，因此，需要有效消除其抑菌成分的影响，避免假阴性。《中华人民共和国药典》[8]2020年版四部通则1105规定，在检验具有抑菌活性的中药制剂时，可采用增加稀释液或培养基体积法、加入适宜的中和剂或灭活剂及薄膜过滤等方法消除供试品抑菌活性。本试验采用增加稀释液体积法进行考察，结果显示该方法能够有效消除加味温胆片供试品对铜绿假单胞菌的抑菌活性。

根据《中华人民共和国药典》[8]2020年版四部1107中的规定，两种中药制剂均不含原生药材及脏器提取物，因此控制菌检查法只考察大肠埃希菌。根据《中华人民共和国药典》[8]2020年版四部1106，进行控制菌检查试验同时采用增加培养基体积法考察了两种中药制剂对大肠埃希菌的抑菌活性，结果显示两种中药制剂对于大肠埃希菌均无抑菌活性，因此可以采用常规法检查。

本研究结果显示，解郁温胆颗粒可采用1∶10浓度按平皿法分别进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数检查，加味温胆片可采用1∶20浓度按平皿法进行需氧菌总数检查，按1∶10浓度进行霉菌和酵母菌总数检查。两种中药制剂的控制菌检查均可按常规法进行。因此，对于抑菌性较强的中药制剂，可采用稀释法消除其抑菌活性，使检验方法简单化、准确化。本研究建立的验证方法简便可靠，易于日常检验操作，可为解郁温胆颗粒和加味温胆片两种中药制剂微生物限度检查提供参考。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

[参考文献]

[1] 吕双宏. 温胆汤临床应用研究进展[J]. 中医药导报，2018，24（20）：123-125.

[2] 王文秀，陈洁，荣立洋，等. 温胆片治疗广泛性焦虑症（痰热内扰证）的临床疗效观察[J]. 广州中医药大学学报，2019，36（11）：1679-1683.

[3] 陈品良，刘晴晴，蔡舒雅，等. 温胆汤加减方治疗冠心病伴抑郁、焦虑临床疗效的Meta分析[J]. 中西医结合心脑血管病杂志，2021，19（23）：4017-4022.

[4] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典[M].一部.北京：中国医药科技出版社，2020：258，76，293，150，217.

[5] 陆超颖，王佳丽，王洪兰，等. 不同基原枳实药材的质量差异评价研究[J]. 中草药，2022，53（14）：4493-4503.

[6] 江水芳，朱雨洁，宋纪池，等. 中药材大黄、五倍子、知母浸出液体外抑菌效果的比较[J]. 生物化工，2024，10（2）：104-107.

[7] 张利仂，肖文斌，钟志坚，等. 含抑菌成分中药片剂的微生物限度检查方法学研究[J]. 工业微生物，2025，55（2）：22-24.

[8] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典[M]. 四部. 北京：中国医药科技出版社，2020：160-171.

[9] 赵同申，秦桂霞，于洪华，等. 恩他卡朋片微生物限度检查方法的建立及验证[J]. 食品与药品，2022，24（4）：362-365.

[10] 刘钰，吴无畏，付书婕，等. 加味消毒饮颗粒微生物限度检查方法学验证[J]. 中国医药导报，2021，18（36）：103-106.

[11] 王静，丁海燕. 酚酸类化合物抑菌作用研究进展[J]. 中成药，2022，44（6）：1906-1911.

[12] 彭华清，李娟，胡桂生，等. 酸橙及其活性成分药理作用的研究现状[J]. 中国临床药理学杂志，2025，41（9）：1346-1350.

Establishment of microbial limit test methods for two solid dosage forms of modified Wendan Formula

HUANG Baoyuan1,2,3,4 QIU Zhenwen1,2,3,4 CHEN Jie5 FANF Hongcheng6 HUANG Yuechun1,2,3,4

1.Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangdong Province, Guangzhou 510405, China; 2.Guangdong Clinical Research Academy of Chinese Medicine, Guangdong Province,Guangzhou 510405, China; 3.Guangdong Province Lingnan Characteristic Hospital Preparation Transformation Engineering Technology Research Center, Guangdong Province, Guangzhou 510405, China; 4.Guangdong Engineering Research Center for Traditional Chinese Medicine Preparations in Medical Institutions and New Drug Conversion of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Province, Guangzhou 510405, China; 5.Department of Medical Technology, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangdong Province, Guangzhou 510405,China; 6.Department of Cardiovascular Diseases, Shenzhen Hospitals of Traditional Chinese and Western Medicine,Guangdong Province, Shenzhen 518014, China

[Abstract] Objective To establish the microbial limit test methods for two preparations of modified Wendan Formula(Jieyu Wendan Granules and modified Wendan Tablets). Methods According to the provisions of the 2020 edition of the Chinese Pharmacopoeia, Part Ⅳ, general rules 1105, 1106,and 1107, methodological studies on microbial enumeration and control bacteria tests were conducted for two preparations. The applicability of the method for counting total aerobic bacteria, total mold and yeast bacteria counts was verified by comparing the recovery ratios of test strains(Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Candida albicans, and Aspergillus niger) in the test solution and the control group, to confirm that the test sample had no antibacterial activity under this testing condition or was within the acceptable range. The applicability of the control organism testing method (Escherichia coli) was evaluated to verify whether this method could effectively detect the target control organism. Results The Jieyu Wendan Granules were tested using a 1∶10 concentration according to the plate method to determine of total aerobic bacteria, total mold and yeast bacteria counts. The recovery ratios of all these tests fell within the specified range of 0.5 to 2.0. The modified Wendan Tablets were tested for total aerobic bacteria, total mold and yeast bacteria counts using the plate method at concentrations of 1:20 and 1:10 respectively. The recovery ratios of all these tests fell within the specified range of 0.5 to 2.0. Both formulations were tested for Escherichia coli using the conventional method, and the corresponding control bacteria were detected in both cases. Conclusion The methods for counting the total aerobic bacteria, total mold and yeast bacteria counts, as well as the control bacteria inspection methods, are all accurate and feasible, and can be used for the microbial limit tests of the two Chinese herbal preparations of the modified Wendan Formula.

[Key words] Modified Wendan Tablets; Jieyu Wendan Granules; Microbial limit; Bacteriostatic activity

[中图分类号] R297.1

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）08（b）-0058-05

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25120217

[基金项目] 广东省广州市科技计划项目——市校（院）企联合资助专项（2023A03J0296）；广东省深圳市宝安中医药发展基金会——中药制剂研发专项（2022KJCX-YYZJ-10）；广东省中医药局课题（20231297）。

[作者简介] 黄宝媛（1989-），女，博士；研究方向：中药制剂开发与中药药理。

[通信作者] 黄月纯（1968-），女，硕士，主任中药师，硕士生导师；研究方向：中药质量标准、特征/指纹图谱、质谱鉴定、中药新制剂研发。

（收稿日期：2025-12-03）

（修回日期：2026-03-19）