生物节律是机体为适应内外环境变化而产生的周期性生理活动，主要包括行为活动节律、睡眠节律和能量代谢节律[1-3]。视交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）作为中枢生物钟的核心，通过生物钟基因构成的转录-翻译反馈环路调控节律输出[4-6]。缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）是细胞氧稳态调节的关键因子，其在常氧条件下也参与神经功能调节，并与生物钟基因存在相互关联[7-9]。一方面，生物钟基因CLOCK/BMAL1可直接结合HIF-1α启动子区域调控其表达[10]；另一方面，HIF-1α也可通过调控PER2等生物钟基因的转录活性，参与节律振荡的调控[11-12]。Six6作为SCN发育和功能维持的关键转录因子，其在SCN中高表达，提示其可能作为SCN神经元的标志分子[13-14]。然而，常氧状态下HIF-1α在SCN中的具体功能尚不明确。本研究利用Six6-Cre与HIF-1α-fl/fl小鼠杂交，构建Six6神经元特异性敲除HIF-1α的小鼠模型，旨在探讨Six6中HIF-1α缺失对小鼠活动节律、睡眠-觉醒及能量代谢节律的影响，为揭示HIF-1α在常氧状态下参与生物节律调控提供实验依据。

1 对象与方法

1.1 实验动物

HIF-1α-fl/fl小鼠由约翰斯·霍普金斯大学Polotsky实验室提供，新疆医科大学动物实验中心饲养管理；Six6-Cre小鼠由苏州大学徐璎教授课题组提供。对照组小鼠和敲除组小鼠是由HIF-1α-fl/fl小鼠和Six6-Cre小鼠杂交配种繁殖得到，委托鼠来宝（武汉）生物科技有限公司代为繁殖，实验动物合格证号：N0.4225MA49JKP5001037，实验动物生产许可证号：SCXK（鄂）2021-0025，实验动物使用许可证号：SYXK（新）2023-004。

本研究中对照组（26只）、敲除组（26只）均选用8周龄、体质量为22～25 g的雄性小鼠。所有小鼠均自由摄食、饮水，并在22～23 ℃的标准、SPF级实验室环境中饲养，光/暗周期为12 h。本研究经新疆医科大学实验动物伦理委员会批准（IACUC-JT-20230811-12）。

1.2 主要试剂与仪器

小鼠基因型鉴定试剂盒（武汉有度生物科技有限公司，货号：YDG01-10）。

倒置荧光显微镜[徕卡显微系统（上海）贸易有限公司，型号：Leica-DMi8]；Clocklab生物节律采集分析系统（美国Actimetrics公司，型号：Actimetrics 6.1.15）；全自动脑立体定位仪（深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司，型号：RWD71000）；动物脑电/肌电数据采集分析系统（江苏易格生物科技有限公司，型号：Medusa）；小动物代谢与行为检测系统（美国Sable Systems International公司，型号：Promethion）。

1.3 PCR鉴定基因型

剪取小鼠尾尖2～3 mm，按照试剂盒说明书进行操作，获取小鼠基因组DNA。取小鼠基因组DNA进行PCR扩增，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；10个循环（95 ℃ 20 s，60 ℃→55 ℃ 20 s，72 ℃ 50 s）；26 个循环（95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 50 s）；72 ℃延伸5 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳筛选目标基因型。使用鉴定HIF-1α-fl/fl的引物进行琼脂糖凝胶电泳，野生型（wild type，WT）小鼠565 bp处出现条带，纯合子（homozygote，HO）小鼠615 bp处出现条带，杂合子（heterozygote，HZ）小鼠565 bp和615 bp处均出现条带。使用鉴定Six6-Cre的引物进行琼脂糖凝胶电泳，转基因（transgenosis，TG）小鼠约200 bp处出现条带，WT没有条带出现。

表1 引物序列

基因名称引物序列（5’→3’）引物（b大p）小HIF-1α-fl/fl正向引物：CGTGTGAGAAAACTTCTGGATG22反向引物：AAAAGTATTGTGTTGGGGCAGT22 Six6-Cre正向引物：AGATGCCAGGACATCAGGAACCTG24反向引物：ATCAGCCACACCAGACACAGAGATC25

1.4 荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）验证

对照组和敲除组选取3只小鼠，采用1.25%阿佛丁进行腹腔注射麻醉，注射剂量为0.2 ml/10 g，麻醉后心脏灌注预冷PBS和4%多聚甲醛，取脑后固定、脱水、OCT胶包埋，制作10 µm冠状切片。HIF-1α和Six6相应的探针合成委托鲲羽（深圳）生物科技有限公司。切片经预处理后，滴加HIF-1α和Six6特异性探针杂交液，40 ℃杂交过夜，经四级信号放大、DAPI染色、脱水封片后，用倒置荧光显微镜采集图像，Image J软件定量分析。

1.5 生物节律分析

1.5.1 Clocklab监测小鼠活动节律 对照组和敲除组选取7只小鼠置入Clocklab生物节律采集分析系统内，单笼单只饲养，并给予充足的水与食物。第1～7天为适应阶段，第8～16天连续记录自发活动，分析每日跑轮活动转次、活动分布曲线振幅（24 h周期下活动分布曲线振幅）、活动周期振幅（每只小鼠在其最佳周期条件下的每日最大活动量）及快速傅里叶变换（fast Fourier transform，FFT）振幅（24 h周期下日常活动经过余弦分析和FFT后的最大幅值）。

1.5.2 睡眠记录仪监测小鼠睡眠节律 对照组和敲除组选取9只小鼠，麻醉后固定于脑立体定位仪，植入前额叶、顶叶脑电图（electroencephalography，EEG）电极及双侧胸锁乳突肌肌电图（electromyography，EMG）电极。术后恢复期满后，将小鼠连接至Sleep Pro睡眠监测系统，在标准光暗周期环境下连续记录EEG/EMG信号。依据脑电波形频率、振幅及肌电活动水平，将睡眠-觉醒周期划分为觉醒（wakefulness，WAKE）、非快速眼动睡眠（non-rapid eye movement sleep，NREM）和快速眼动睡眠（rapid eye movement sleep，REM），统计各状态的持续时间及在光暗周期中的分布规律，评估睡眠节律特征。

1.5.3 代谢笼监测小鼠能量代谢节律 对照组和敲除组选取7只小鼠，单独放置于代谢笼中，第1～3天为适应阶段，第4天从ZT0（北京时间9∶00时）起连续记录24 h。监测期间保持标准饲养环境（12 h/12 h光暗周期，ZT0～ZT12为光照期，ZT12～ZT24为黑暗期）。监测指标包括：耗氧量（oxygen consumption，VO2）、二氧化碳产生量（carbon dioxide output，VCO2）、呼吸交换率（respiratory entropy，RER）、能量消耗（energy expenditure，EE）及进食量。所有数据通过Sable Systems专业分析软件处理。

1.6 统计学方法

采用GraphPad Prism 9统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差表示，组间比较采用t检验；涉及睡眠节律和能量代谢节律相关指标采用双因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 特异性敲除小鼠模型的验证

2.1.1 小鼠基因型鉴定 所有纳入实验的对照组小鼠经鉴定均为Six6-WT∶∶HIF-1α-fl/fl小鼠（WT+HO），而敲除组小鼠均为Six6-Cre∶∶HIF-1α-fl/fl小鼠（TG+HO）。见图1。

图1 小鼠基因型鉴定

2.1.2 FISH鉴定 与对照组比较，敲除组HIF-1α在SCN中的相对荧光强度降低，HIF-1α与Six6共定位占比降低（P＜0.01）。见图2、图3。

图2 SCN的FISH代表图（×20）

图3 FISH鉴定结果（n=3）

2.2 Six6神经元HIF-1α敲除对小鼠活动节律的影响

两组小鼠活动均存在昼夜节律，但敲除组小鼠黑暗期活动量减少。与对照组比较，敲除组每日跑轮活动转次减少，活动分布曲线振幅、活动周期振幅、FFT振幅减小（P＜0.05或P＜0.01）。见图4。

图4 两组活动节律比较

2.3 Six6神经元HIF-1α敲除对小鼠睡眠节律的影响

两组黑暗期WAKE时间长于光照期，NREM、REM时间短于光照期（P＜0.01）。与对照组比较，敲除组全天NREM时间延长（P＜0.05）；两组全天WAKE、REM时间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5。

图5 各组睡眠节律比较（n=9）

2.4 Six6神经元HIF-1α敲除对小鼠能量代谢节律的影响

两组黑暗期VO2、VCO2、RER、EE及进食量高于光照期（P＜0.01）。与对照组比较，敲除组黑暗期进食量减少（P＜0.05）；两组全天VO2、VCO2、RER、EE、进食量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图6。

图6 各组能量代谢节律比较（n=7）

3 讨论

本研究聚焦SCN组织Six6神经元中HIF-1α的功能，通过构建特异性敲除小鼠模型，从行为活动、睡眠-觉醒及能量代谢3个核心维度探究其对小鼠生物节律输出的调控作用。

行为活动节律分析发现，HIF-1α在Six6神经元中的正常表达是小鼠行为活动节律维持稳定的必要条件，缺失会直接引发行为节律的显著异常，不仅降低小鼠自主活动的整体活跃度，更严重削弱了行为节律的昼夜差异性、峰值强度及固有稳定性，而非单纯的活动量下降[15-17]。

睡眠-觉醒节律分析发现，两组小鼠虽仍保持基本的昼夜睡眠节律特征（即黑暗期WAKE时间长于光照期、睡眠时间短于光照期），但敲除组的睡眠结构已发生改变。HIF-1α在Six6神经元中的正常表达是维持小鼠黑暗期睡眠-觉醒节律稳态的关键。睡眠-觉醒节律作为生物节律的重要组成部分，其调控依赖于SCN与下丘脑睡眠调控核团的精密协作，推测HIF-1α缺失干扰SCN与睡眠调控核团的投射，影响觉醒信号驱动[18-22]。

能量代谢节律分析发现，Six6神经元中HIF-1α的特异性敲除，不仅引发小鼠能量代谢节律的异常，更与睡眠节律异常形成高度协同调控效应。HIF-1α敲除可能首先通过影响SCN神经元功能，一方面重塑黑暗期睡眠结构；另一方面同步调控夜间能量代谢的关键环节，包括代谢峰值强度、能量底物利用模式及进食行为，使能量代谢的时间特异性异常与睡眠节律紊乱高度契合，进一步凸显其在整合睡眠-能量代谢节律、维持小鼠夜间生理稳态中的作用。从机制层面推测，HIF-1α缺失可能通过干扰SCN节律信号的转换效率，抑制外周代谢器官在昼夜交替时段的脂肪氧化功能，进而导致RER延长，体现其对能量底物利用模式的精准调控作用[23-24]。此外，敲除组小鼠黑暗期整体进食量显著减少，提示进食量的节律异常可能源于SCN节律调控紊乱[25]；而进食量减少也可能是导致代谢峰值降低的重要原因之一，进一步印证HIF-1α缺失对夜间生理状态的系统性调控效应，也为行为活动节律、睡眠节律异常的分子关联提供了代谢层面的支撑。

本研究存在一定的局限性：尚未明确HIF-1α与核心生物钟基因的直接分子交互及转录调控关系。后续研究需聚焦上述局限性，完善分子调控机制研究，明确HIF-1α与核心生物钟基因的调控关系。

综上所述，Six6神经元中的HIF-1α是维持小鼠夜间生物节律稳态的关键因子，其缺失可同步导致小鼠行为活动、睡眠-觉醒及能量代谢节律异常。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

[参考文献]

[1] 张春桃，马涛，屠焰，等. 生物节律对动物生理营养及物质消化利用调控的研究进展[J]. 畜牧兽医学报，2021，52（4）：872-880.

[2] Allada R，Bass J. Circadian mechanisms in medicine [J]. N Engl J Med，2021，384（6）：550-561.

[3] Healy K L，Morris A R，Liu A C. Circadian synchrony：sleep，nutrition，and physical activity [J]. Front Netw Physiol，2021，1：732243.

[4] Ma M A， Morrison E H. Neuroanatomy, nucleus suprachiasmatic [M/OL]//StatPearls.（2023-07-24）[2025-12-01].https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK546664/.

[5] Zhuang Y，Li Z，Xiong S，et al. Circadian clocks are modulated by compartmentalized oscillating translation [J]. Cell，2023，186（15）：3245-3260.

[6] 唐雅雪，金风. 生物钟与缺氧诱导因子1的相互作用[J].现代肿瘤医学，2021，29（12）：2191-2194.

[7] Rozjan A，Shan W，Yao Q. Metabolic consequences of neuronal HIF1α-deficiency in mediobasal hypothalamus in mice [J]. Front Endocrinol（Lausanne），2021，12：668193.

[8] Nakamura A，Jo S，Nakamura S，et al. HIF-1alpha and MIF enhance neutrophil-driven type 3 immunity and chondrogenesis in a murine spondyloarthritis model [J]. Cell Mol Immunol，2024，21（7）：770-786.

[9] Choudhry H，Harris A L. Advances in hypoxia-inducible factor biology [J]. Cell Metab，2018，27（2）：281-298.

[10] Dandavate V，Bolshette N，Van Drunen R，et al. Hepatic BMAL1 and HIF1α regulate a time-dependent hypoxic response and prevent hepatopulmonary-like syndrome [J].Cell Metab，2024，36（9）：2038-2053.

[11] Peek C B，Levine D C，Cedernaes J，et al. Circadian clock interaction with HIF1alpha mediates oxygenic metabolism and anaerobic glycolysis in skeletal muscle [J]. Cell Metab，2017，25（1）：86-92.

[12] Adamovich Y，Dandavate V，Asher G. Circadian clocks’ interactions with oxygen sensing and signalling [J]. Acta Physiol（Oxf），2022，234（2）：e13770.

[13] Larder R，Clark D D，Miller N L G，et al. Hypothalamic dysregulation and infertility in mice lacking the homeodomain protein Six6 [J]. J Neurosci，2011，31（2）：426-438.

[14] Pandolfi E C，Breuer J A，Nguyen Huu V A，et al. The homeodomain transcription factors Vax1 and Six6 are required for SCN development and function [J]. Mol Neurobiol，2020，57（2）：1217-1232.

[15] Zhang J，Chang M，Wang X，et al. Pterostilbene targets the molecular oscillator RORgamma to restore circadian rhythm oscillation and protect against sleep restriction induced metabolic disorders [J]. Phytomedicine，2024，125：155327.

[16] Kurosawa G，Fujioka A，Koinuma S，et al. Temperatureamplitude coupling for stable biological rhythms at different temperatures [J]. PLoS Comput Biol，2017，13（6）：e1005501.

[17] Di Milia L，Folkard S. More than morningness：the effect of circadian rhythm amplitude and stability on resilience，coping，and sleep duration [J]. Front Psychol，2021，12：782349.

[18] Saper C B，Scammell T E，Lu J. Hypothalamic regulation of sleep and circadian rhythms [J]. Nature，2005，437（7063）：1257-1263.

[19] Scheen A J，Lefebvre P J. Glucagon，from past to present：a century of intensive research and controversies [J]. Lancet Diabetes Endocrinol，2023，11（2）：129-138.

[20] Jia X，Song Y，Li Z，et al. Melatonin regulates the circadian rhythm to ameliorate postoperative sleep disorder and neurobehavioral abnormalities in aged mice [J]. CNS Neurosci Ther，2024，30（3）：e14436.

[21] Wang T A，Yu Y V，Govindaiah G，et al. Circadian rhythm of redox state regulates excitability in suprachiasmatic nucleus neurons [J]. Science，2012，337（6096）：839-842.

[22] Blume C，Munch M. Effects of light on biological functions and human sleep [J]. Handb Clin Neurol，2025，206：3-16.

[23] Rohr M W，Narasimhulu C A，Rudeski-Rohr T A，et al.Negative effects of a high-fat diet on intestinal permeability：a review [J]. Adv Nutr，2020，11（1）：77-91.

[24] Asher G，Sassone-Corsi P. Time for food：the intimate interplay between nutrition，metabolism，and the circadian clock [J]. Cell，2015，161（1）：84-92.

[25] Turek F W，Joshu C，Kohsaka A，et al. Obesity and metabolic syndrome in circadian Clock mutant mice [J]. Science，2005，308（5724）：1043-1045.

Effect of HIF-1α knockout in Six6 neurons on the biological rhythm output of mice

DENG Qi1,2,3,4 MA Xueyun1 LIU Siyu1 KANG Shuyuan1 Alimujiang Paierhati5 YAO Qiaoling1,2,3,4

1.Department of Physiology, School of Basic Medicine, Xinjiang Medical University, Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830017, China; 2.Xinjiang Key Laboratory of Molecular Biology for Endemic Diseases, Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830017, China; 3.Scientific Research Platform of Xinjiang Medical University Key Laboratory of Neurophysiology and Clinical Translation, Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830017, China;4.State Key Laboratory of Pathogenesis, Prevention and Treatment of High Incidence Diseases in Central Asia, Xinjiang Medical University, Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830011, China; 5.Xinjiang Uyghur Autonomous Region Uyghur Medicinal Materials and Quality Control Engineering Research Center, Xinjiang Hetian College,Xinjiang Uygur Autonomous Region, Hetian 848000, China

[Abstract] Objective To investigate the effect of hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) knockout in Six6 neurons on the biological rhythms output of mice, including behavioral activity rhythm, sleep rhythm, and energy metabolism rhythm. Methods The Six6 neuron-specific knockout HIF-1α mouse model was constructed, and the genotypes of mice were identified by PCR amplification gel electrophoresis. Twenty-six mice in each of control group and knockout group were selected. Fluorescence in situ hybridization was used to verify the expression changes of HIF-1α in Six6 neurons in the suprachiasmatic nucleus (SCN) brain region;the Clocklab biological rhythm system was used to analyze the activity rhythms (the number of rotations of the daily running wheel activity, the amplitude of the activity distribution curve, the amplitude of the activity cycle, and the amplitude of the fast Fourier transform [FFT]); the electroencephalogram/electromyogram data acquisition and analysis system was used to record the sleep rhythms (wakefulness [WAKE], non-rapid eye movement sleep [NREM], and rapid eye movement sleep [REM]); metabolic cages were used to monitor energy metabolism rhythms (oxygen consumption [VO2], carbon dioxide output [VCO2], respiratory entropy [RER], energy expenditure [EE], and food intake). Results All the control group mice included in the experiment were identified as Six6-WT∶∶HIF-1α-fl/fl mice (WT+HO), while all the knockout group mice were identified as Six6-Cre∶∶HIF-1α-fl/fl mice (TG+HO). Compared with the control group, the relative fluorescence intensity of HIF-1α in the SCN of the knockout group decreased, and the proportion of co-localization of HIF-1α and Six6 decreased (P＜0.01). Compared with the control group, the number of rotations of the daily running wheel activity, the amplitude of the activity distribution curve, the amplitude of the activity cycle, and the amplitude of FFT of the knockout group (P＜0.05 or P＜0.01). Compared with the control group, the NREM time throughout the day of the knockout group was prolonged (P＜0.05); there were no statistically significant difference in the WAKE and REM time throughout the day between the two groups (P＞0.05). Compared with the control group, food intake during the dark period in the knockout group decreased (P＜0.05); there were no statistically significant differences in VO2, VCO2, RER,EE, and food intake between the two groups throughout the day (P＞0.05). Conclusion The absence of HIF-1α in Six6 neurons may alter the biological rhythm output of mice, including activity rhythm, sleep rhythm and energy metabolism rhythm, by affecting the function of the SCN.

[Key words] Hypoxia-inducible factor-1α; Six6; Suprachiasmatic nucleus; Circadian rhythm

[中图分类号] R332

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）08（c）-0051-08

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25120116

[基金项目] 新疆维吾尔自治区自然科学基金杰出青年科学基金资助项目（2024D01E19）；省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室开放课题资助项目（SKL-HIDCA-2022-4）。

[作者简介] 邓淇（1999.6-），女，新疆医科大学基础医学院2022级生理学专业在读硕士研究生；研究方向：睡眠生理。

[通信作者] 姚巧玲（1977.3-），女，博士，教授，博士生导师；研究方向：睡眠生理。

（收稿日期：2025-12-02）

（修回日期：2026-03-20）